تکنیک الایزا ساندویچ

الایزا ساندویچ چیست؟ (Sandwich ELISA)

الایزا ساندویچ یکی از پرکاربردترین و دقیق ترین تکنیک های ایمونولوژیک آزمایشگاهی است که برای شناسایی و اندازه گیری مقدار یک آنتی ژن خاص (معمولاً پروتئین ها، هورمون ها، سیتوکاین ها یا مارکرهای بیماری) در نمونه های بیولوژیک مانند سرم، پلاسما، ادرار یا محیط کشت سلولی استفاده می شود.

به زبان خیلی ساده:
در الایزا ساندویچ، آنتی ژن مورد نظر بین دو آنتی بادی اختصاصی «گیر می افتد»؛ درست مثل یک ساندویچ که ماده ی اصلی آن وسط دو لایه نان قرار می گیرد. به همین دلیل نام این روش «ساندویچ» گذاشته شده است.

تعریف علمی الایزا ساندویچ

الایزا ساندویچ یک روش ایمونواسی آنزیمی (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) است که در آن، آنتی ژن هدف توسط یک آنتی بادی تثبیت شده روی فاز جامد (Capture Antibody) به دام می افتد و سپس توسط آنتی بادی دوم نشاندار شده با آنزیم (Detection Antibody) شناسایی و اندازه گیری می شود. شدت سیگنال تولیدشده متناسب با غلظت آنتی ژن موجود در نمونه است.

تاریخچه تکنیک ELISA و پیدایش الایزا ساندویچ

روش ELISA برای اولین بار در اوایل دهه ۱۹۷۰ میلادی معرفی شد.
تقریباً هم زمان دو گروه پژوهشی مستقل:

Engvall و Perlmann

Van Weemen و Schuurs

موفق شدند ایده ی اتصال آنزیم به آنتی بادی را به عنوان جایگزین ایمن تر برای مواد رادیواکتیو (RIA) ارائه دهند.

در ابتدا، الایزا به صورت های ساده تر مانند:

Direct ELISA

Indirect ELISA

به کار می رفت، اما با افزایش نیاز به دقت بالاتر و کاهش خطا، الایزا ساندویچ توسعه پیدا کرد. این روش به ویژه برای اندازه گیری آنتی ژن های بزرگ با چند اپی توپ بسیار مناسب بود.

به تدریج، الایزا ساندویچ به استاندارد طلایی بسیاری از آزمایش های تشخیصی و تحقیقاتی تبدیل شد.

محدوده فعالیت و حساسیت الایزا ساندویچ

الایزا ساندویچ به دلیل استفاده از دو آنتی بادی اختصاصی، دارای اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا است.

محدوده تشخیص:

معمولاً در حد پیکوگرم بر میلی لیتر (pg/mL)

در برخی کیت ها حتی کمتر

دامنه خطی:

گسترده و قابل تنظیم با رقت نمونه

ویژگی مهم:

کاهش نویز زمینه (Background)

حداقل واکنش های غیر اختصاصی

به همین دلیل، این روش برای نمونه هایی با غلظت پایین آنتی ژن بسیار ایده آل است.

اصل و منطق عملکرد الایزا ساندویچ (خیلی ساده)

سه عنصر اصلی در این تکنیک وجود دارد:

آنتی بادی گیرنده (Capture Antibody)

آنتی ژن نمونه

آنتی بادی آشکارساز (Detection Antibody)

مراحل به صورت خلاصه:

آنتی بادی اول روی سطح پلیت می نشیند

آنتی ژن نمونه به آن متصل می شود

آنتی بادی دوم به آنتی ژن می چسبد

یک آنزیم باعث ایجاد رنگ می شود

شدت رنگ = مقدار آنتی ژن

روش انجام الایزا ساندویچ
1. پوشش دهی پلیت (Coating)

چاهک های پلیت ELISA با آنتی بادی گیرنده اختصاصی پوشانده می شوند.
این آنتی بادی به صورت غیرفعال به سطح پلاستیکی متصل می شود.

2. مرحله بلوکه کردن (Blocking)

برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی:

از موادی مثل BSA، شیر خشک یا ژلاتین استفاده می شود

این مرحله دقت آزمایش را به شدت افزایش می دهد

3. افزودن نمونه

نمونه ی حاوی آنتی ژن به چاهک اضافه می شود.
آنتی ژن به آنتی بادی گیرنده متصل می گردد.

4. شست وشو (Washing)

چاهک ها چندین بار شسته می شوند تا:

مواد اضافی

آنتی ژن های غیرمتصل
حذف شوند.

5. افزودن آنتی بادی آشکارساز

آنتی بادی دوم که به اپی توپی متفاوت از آنتی ژن متصل می شود، اضافه می گردد.
این آنتی بادی معمولاً:

مستقیماً به آنزیم متصل است
یا

به صورت غیرمستقیم آشکارسازی می شود

6. افزودن سوبسترا

سوبسترای آنزیمی (مانند TMB) اضافه می شود.
آنزیم باعث ایجاد واکنش رنگی می گردد.

7. توقف واکنش

با افزودن محلول توقف (Stop Solution)، واکنش متوقف می شود.

8. قرائت جذب نوری

شدت رنگ توسط الایزا ریدر (ELISA Reader) در طول موج مشخص (معمولاً 450 نانومتر) اندازه گیری می شود.

9. محاسبه غلظت

غلظت نمونه با استفاده از منحنی استاندارد تعیین می شود.

کاربردهای الایزا ساندویچ
1. تشخیص بیماری های عفونی

شناسایی آنتی ژن ویروس ها و باکتری ها

HIV، هپاتیت، کرونا، آنفلوانزا

2. تشخیص بیماری های التهابی و خودایمنی

سیتوکاین ها (IL-6، TNF-α)

فاکتورهای التهابی

3. اندازه گیری هورمون ها

انسولین

فریتین

هورمون های رشد و متابولیک

4. تحقیقات سلولی و مولکولی

بررسی ترشح پروتئین ها در محیط کشت

آنالیز مسیرهای سیگنالینگ

5. کنترل کیفیت و صنایع زیستی

بیوتکنولوژی

داروسازی

واکسن سازی

نتایج حاصل از الایزا ساندویچ

نتایج این روش:

کاملاً کمی (Quantitative) هستند

قابلیت تکرارپذیری بالایی دارند

وابسته به کیفیت آنتی بادی ها هستند

خروجی معمولاً به صورت:

pg/mL

ng/mL

گزارش می شود و برای مقایسه های بالینی و تحقیقاتی بسیار قابل اعتماد است.

محدودیت ها و ملاحظات

نیاز به آنتی بادی های بسیار اختصاصی

مناسب نبودن برای آنتی ژن های بسیار کوچک (با یک اپی توپ)

هزینه بالاتر نسبت به ELISA غیرمستقیم

حساسیت به شرایط شست وشو و دما