تکنیک الایزای غیرمستقیم

الایزای غیرمستقیم چیست؟ (Indirect ELISA)

الایزای غیرمستقیم (Indirect ELISA) یک روش آزمایشگاهی ایمونولوژیک کمی و حساس است که برای تشخیص و اندازه گیری حضور آنتی بادی ها در نمونه ها استفاده می شود.

به زبان ساده:
در Indirect ELISA، آنتی ژن روی سطح میکروتیتر پلیت تثبیت می شود و سپس نمونه حاوی آنتی بادی احتمالی به آن اضافه می شود. پس از اتصال آنتی بادی به آنتی ژن، یک آنتی بادی ثانویه نشاندار شده با آنزیم اضافه می شود که به آنتی بادی اولیه متصل می شود. با افزودن سوبسترا، رنگ تولید می شود و شدت آن با غلظت آنتی بادی موجود در نمونه نسبت مستقیم دارد.

Indirect ELISA حساس تر از Direct ELISA است، زیرا استفاده از آنتی بادی ثانویه باعث تقویت سیگنال می شود و امکان شناسایی مقادیر کم آنتی بادی را فراهم می کند.

تعریف علمی

Indirect ELISA یک روش ایمونواسی کمی یا نیمه کمی است که در آن:

آنتی ژن ها روی سطح جامد میکروتیتر پلیت جذب می شوند.

نمونه حاوی آنتی بادی اولیه به پلیت اضافه می شود و با آنتی ژن اختصاصی واکنش می دهد.

آنتی بادی ثانویه نشاندار شده با آنزیم به آنتی بادی اولیه متصل می شود.

افزودن سوبسترا باعث تولید رنگ می شود که شدت آن با مقدار آنتی بادی اولیه موجود در نمونه نسبت مستقیم دارد.

این روش امکان تشخیص و اندازه گیری دقیق آنتی بادی ها در سرم، مایعات بدن و نمونه های تحقیقاتی را فراهم می کند.

تاریخچه Indirect ELISA

ELISA در دهه ۱۹۶۰ میلادی معرفی شد تا جایگزینی برای روش های رادیوایمونواسی باشد.

نسخه غیرمستقیم (Indirect ELISA) برای افزایش حساسیت و کاهش نیاز به آنتی بادی نشاندار اولیه توسعه یافت.

در این روش، یک آنتی بادی ثانویه نشاندار با آنزیم استفاده می شود که به آنتی بادی اولیه متصل می شود.

این تکنیک از دهه ۱۹۷۰ در آزمایشگاه های بالینی و تحقیقاتی برای تشخیص آنتی بادی های ضد ویروس، باکتری یا پروتئین های خاص به کار رفت.

Indirect ELISA به سرعت به استاندارد طلایی برای بررسی پاسخ ایمنی و سطح آنتی بادی در سرم بیماران تبدیل شد.

محدوده فعالیت و حساسیت

حساسیت:
بسیار بالا به دلیل استفاده از آنتی بادی ثانویه نشاندار

دامنه کاربرد:

شناسایی و سنجش آنتی بادی های IgG, IgM, IgA در سرم

بررسی پاسخ ایمنی به واکسن ها یا عفونت ها

تحقیقات پایه و پیشرفته در ایمنی شناسی

ویژگی عملیاتی:

قابل اعتماد و دقیق

مناسب برای نمونه های با غلظت کم آنتی بادی

امکان پردازش همزمان تعداد زیاد نمونه ها

اصل و منطق عملکرد Indirect ELISA

تثبیت آنتی ژن روی سطح جامد:
آنتی ژن به میکروتیتر پلیت جذب می شود.

بلوک کردن سطح:
با مواد بلوکر (BSA، ژلاتین یا شیر خشک) برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی ها.

افزودن آنتی بادی اولیه:
نمونه ها (سرم یا محلول آنتی بادی) به پلیت اضافه می شوند و واکنش اختصاصی با آنتی ژن برقرار می کنند.

شست وشوی اضافی:
حذف آنتی بادی های غیر متصل.

افزودن آنتی بادی ثانویه نشاندار:
آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می شود و سیگنال آنزیمی ایجاد می کند.

واکنش سوبسترا با آنزیم:
تولید رنگ متناسب با مقدار آنتی بادی اولیه.

اندازه گیری سیگنال:
خواندن با اسپکتروفوتومتر یا دستگاه خواننده پلیت و تعیین مقدار آنتی بادی با استفاده از منحنی استاندارد.

روش انجام Indirect ELISA (مرحله به مرحله)
1. آماده سازی پلیت

ریختن آنتی ژن در چاهک ها

انکوباسیون برای جذب به سطح جامد

2. بلوک کردن سطح

افزودن بلوکر برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی

انکوباسیون کوتاه و شست وشوی اولیه

3. افزودن نمونه ها (آنتی بادی اولیه)

سرم یا محلول آنتی بادی به چاهک ها اضافه می شود

واکنش اختصاصی با آنتی ژن برقرار می شود

4. شست وشو

حذف آنتی بادی های غیر متصل با محلول شست وشو

5. افزودن آنتی بادی ثانویه نشاندار

آنتی بادی ثانویه نشاندار با آنزیم (HRP یا AP) به چاهک ها اضافه می شود

اتصال به آنتی بادی اولیه صورت می گیرد

6. شست وشوی نهایی

حذف آنتی بادی ثانویه غیر متصل

7. افزودن سوبسترا و تولید سیگنال

سوبسترا با آنزیم واکنش داده و رنگ ایجاد می شود

شدت رنگ متناسب با غلظت آنتی بادی اولیه است

8. اندازه گیری و تحلیل نتایج

خواندن سیگنال با دستگاه مناسب

محاسبه مقدار آنتی بادی با استفاده از منحنی استاندارد

کاربردهای Indirect ELISA
1. تشخیص آنتی بادی ها

شناسایی IgG, IgM, IgA در سرم بیماران

بررسی پاسخ ایمنی پس از واکسیناسیون یا عفونت ها

2. تحقیقات ایمونولوژیک

سنجش پاسخ ایمنی سلولی یا هومورال

بررسی سطح آنتی بادی ها در مدل های حیوانی یا انسانی

3. کنترل کیفیت محصولات بیوتکنولوژی

بررسی حضور آنتی بادی های هدف در واکسن ها یا کیت های تشخیصی

4. آزمایشگاه های آموزشی

آموزش تکنیک های ELISA و تقویت مهارت دانشجویان

5. کاربردهای تشخیصی

تشخیص بیماری های خودایمنی

سنجش آنتی بادی های ضد عوامل عفونی خاص

نتایج حاصل

خروجی: رنگ ایجاد شده در چاهک ها

شدت رنگ با غلظت آنتی بادی اولیه موجود نسبت مستقیم دارد

با منحنی استاندارد می توان مقدار آنتی بادی را کمی تعیین کرد

نتایج کمی و دقیق تر از Direct ELISA هستند

قابل ثبت و مقایسه بین نمونه ها

محدودیت ها و نکات مهم

نیاز به آنتی بادی ثانویه مناسب و نشاندار شده

زمان انجام طولانی تر نسبت به Direct ELISA

حساسیت بسیار بالا ولی احتمال ایجاد سیگنال زمینه ای (Background) در صورت عدم شست وشوی دقیق

مناسب برای تعداد زیاد نمونه و اندازه گیری کمیت آنتی بادی ها

نیاز به کنترل های مثبت و منفی برای دقت بالا