تکنیک الایزای مستقیم

الایزای مستقیم چیست؟ (Direct ELISA)

الایزای مستقیم (Direct ELISA) یک روش آزمایشگاهی ایمونولوژیک سریع و ساده است که برای تشخیص و اندازه گیری مستقیم حضور پروتئین ها، آنتی ژن ها یا سایر مولکول ها در نمونه ها استفاده می شود.

به زبان ساده:
در Direct ELISA، نمونه ای که حاوی آنتی ژن هدف است، روی سطح یک پلیت (مانند میکروتیتر) تثبیت می شود و سپس با آنتی بادی نشاندار شده با آنزیم واکنش داده می شود. آنزیم پس از افزودن سوبسترا، رنگ تولید می کند که شدت آن با مقدار آنتی ژن موجود در نمونه نسبت مستقیم دارد.

این روش ساده ترین و سریع ترین نسخه ELISA است، زیرا تنها از یک آنتی بادی استفاده می کند و نیاز به آنتی بادی ثانویه ندارد.

تعریف علمی Direct ELISA

Direct ELISA یک روش ایمونواسی کمی یا نیمه کمی است که در آن آنتی ژن ها به سطح جامد میکروپلیت جذب شده و سپس با آنتی بادی اولیه نشاندار شده (Enzyme-Conjugated Primary Antibody) واکنش می دهند.

پس از افزودن سوبسترا، واکنش آنزیمی تولید سیگنال قابل مشاهده می کند. شدت سیگنال به مقدار آنتی ژن موجود در نمونه بستگی دارد و با استفاده از منحنی استاندارد می توان مقدار آن را کمی تعیین کرد.

تاریخچه Direct ELISA

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) برای اولین بار در دهه ۱۹۶۰ میلادی معرفی شد، زمانی که تکنیک های رادیوایمونواسی به دلیل مشکلات امنیتی و هزینه محدودیت داشتند.

روش مستقیم (Direct ELISA) یکی از اولین نسخه های ELISA بود که ساده ترین طراحی را داشت و امکان شناسایی سریع آنتی ژن ها را بدون نیاز به آنتی بادی ثانویه فراهم می کرد.

توسعه Direct ELISA نقطه شروعی برای ایجاد نسخه های پیشرفته تر مانند Indirect ELISA و Sandwich ELISA بود.

از آن زمان تاکنون، Direct ELISA در آزمایشگاه های تحقیقاتی، بالینی و صنعتی به عنوان ابزاری سریع و قابل اعتماد برای شناسایی پروتئین ها و آنتی ژن ها مورد استفاده قرار گرفته است.

محدوده فعالیت و حساسیت

حساسیت:
Direct ELISA معمولاً حساسیت کمتری نسبت به روش های غیرمستقیم و ساندویچ ELISA دارد، زیرا تنها یک مرحله آنتی بادی سیگنال تولید می کند. با این حال، برای نمونه های با غلظت بالای آنتی ژن مناسب است.

دامنه کاربرد:

شناسایی پروتئین ها یا آنتی ژن های خالص یا نیمه خالص

بررسی سریع واکنش نمونه ها

کاربرد در تحقیقات پایه، غربالگری سریع و آزمایش های بالینی اولیه

ویژگی عملیاتی:

ساده، سریع و کم هزینه

نیاز به یک آنتی بادی نشاندار شده (بدون نیاز به آنتی بادی ثانویه)

مناسب برای نمونه های محدود و پردازش تعداد کم

اصل و منطق عملکرد Direct ELISA

تثبیت آنتی ژن روی سطح جامد:
نمونه حاوی آنتی ژن به میکروتیتر پلیت اضافه می شود و مولکول ها به سطح جاذب (Polystyrene) می چسبند.

بلوک کردن سطح:
برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی، سطح با مواد بلوکر مانند BSA یا شیر خشک پوشانده می شود.

افزودن آنتی بادی نشاندار:
آنتی بادی اولیه که با آنزیم مانند HRP یا AP نشاندار شده است، به پلیت اضافه می شود.

واکنش آنتی ژن–آنتی بادی:
آنتی بادی اختصاصی به آنتی ژن متصل می شود.

شست وشو:
آنتی بادی های غیر متصل با محلول شست وشو حذف می شوند.

افزودن سوبسترا:
سوبسترا با آنزیم واکنش داده و رنگ تولید می کند.

اندازه گیری سیگنال:
شدت رنگ با اسپکتروفوتومتر یا خواننده پلیت اندازه گیری می شود و با منحنی استاندارد مقدار آنتی ژن تعیین می شود.

روش انجام Direct ELISA (مرحله به مرحله)
1. آماده سازی پلیت

استفاده از میکروتیتر پلیت با سطح جاذب پروتئین

اضافه کردن نمونه ها (آنتی ژن) و اجازه جذب آنها

2. بلوک کردن سطح

افزودن محلول بلوکر (BSA، ژلاتین یا شیر خشک)

جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی

3. افزودن آنتی بادی اولیه نشاندار

آنتی بادی مستقیم با آنزیم متصل (HRP یا AP)

انکوباسیون چند دقیقه تا ساعت

4. شست وشو

حذف آنتی بادی های غیر متصل با محلول شست وشو

5. افزودن سوبسترا

سوبسترا با آنزیم واکنش داده و سیگنال رنگی ایجاد می کند

زمان واکنش و شدت رنگ بسته به آنزیم و سوبسترا متفاوت است

6. ثبت نتایج

خواندن سیگنال با اسپکتروفوتومتر یا خواننده پلیت

مقایسه با منحنی استاندارد برای تعیین غلظت آنتی ژن

کاربردهای Direct ELISA
1. تشخیص سریع آنتی ژن ها

شناسایی پروتئین های خالص یا نیمه خالص در نمونه ها

کاربرد در غربالگری سریع نمونه های بالینی یا تحقیقاتی

2. تحقیقات پایه

بررسی بیان پروتئین ها در سلول ها یا بافت ها

شناسایی مولکول های ایمونولوژیک

3. کنترل کیفیت محصولات بیوتکنولوژی

بررسی حضور پروتئین ها در واکسن ها، کیت ها و محصولات دارویی

4. آزمایشگاه های آموزشی

آموزش روش های ELISA به دانشجویان و محققان تازه کار

5. بررسی واکنش های اختصاصی

مطالعه اتصال مستقیم آنتی بادی ها به آنتی ژن بدون نیاز به مراحل پیچیده

نتایج حاصل از Direct ELISA

خروجی: رنگ ایجاد شده در چاهک ها

شدت رنگ با غلظت آنتی ژن موجود نسبت مستقیم دارد

با استفاده از منحنی استاندارد، مقدار آنتی ژن قابل تعیین است

نتایج کمی یا نیمه کمی گزارش می شوند

سریع، واضح و قابل تفسیر با حداقل ابزار

محدودیت ها و نکات مهم

حساسیت کمتر نسبت به Indirect یا Sandwich ELISA

استفاده محدود برای نمونه های با غلظت پایین آنتی ژن

نیاز به آنتی بادی نشاندار با آنزیم برای هر آنتی ژن

مناسب برای نمونه های محدود و تست های سریع، اما در پردازش تعداد زیاد نمونه ممکن است پرهزینه باشد

نیاز به کنترل های مثبت و منفی برای دقت بالا