تکنیک ایمونوفلورسانس مستقیم

تکنیک ایمونوفلورسانس مستقیم چیست؟

ایمونوفلورسانس مستقیم (Direct Immunofluorescence – DIF) یکی از روش های مهم و دقیق در آزمایشگاه های پاتولوژی و ایمونولوژی است که برای شناسایی و مشاهده ی مستقیم آنتی ژن ها یا رسوبات ایمنی در بافت ها استفاده می شود. این تکنیک بر پایه ی اتصال اختصاصی آنتی بادی به آنتی ژن و آشکارسازی آن با استفاده از رنگ های فلورسنت طراحی شده است.

تعریف ساده تکنیک ایمونوفلورسانس مستقیم

ایمونوفلورسانس مستقیم روشی آزمایشگاهی است که در آن آنتی بادیِ نشاندار شده با ماده ی فلورسنت مستقیماً به آنتی ژن موجود در نمونه بافتی متصل می شود و سپس با میکروسکوپ فلورسنت قابل مشاهده می گردد.

توضیح به زبان ساده تکنیک ایمونوفلورسانس مستقیم

در بدن ما وقتی سیستم ایمنی با یک عامل خارجی مثل باکتری، ویروس یا حتی بعضی بیماری های خودایمنی روبه رو می شود، پروتئین هایی به نام آنتی بادی تولید می کند. این آنتی بادی ها به مولکول های خاصی به نام آنتی ژن متصل می شوند. در روش DIF، دانشمندان از همین ویژگی طبیعی استفاده می کنند. آن ها آنتی بادی هایی می سازند که به یک ماده ی درخشان (فلورسنت) متصل شده اند. وقتی این آنتی بادی های درخشان روی یک نمونه ی بافتی قرار می گیرند، اگر آنتی ژن هدف در آن بافت وجود داشته باشد، آنتی بادی به آن می چسبد. بعد نمونه را زیر میکروسکوپ فلورسنت می گذارند و محل اتصال مثل یک نور سبز یا قرمز درخشان دیده می شود. این درخشش نشان می دهد که آن آنتی ژن در آن نقطه وجود دارد.

تاریخچه ایمونوفلورسانس مستقیم

پایه های این روش به دهه ی 1940 میلادی برمی گردد. در سال 1941، دو دانشمند به نام های آلبرت کونز (Albert Coons) و همکارانش برای نخستین بار موفق شدند آنتی بادی ها را با رنگ های فلورسنت نشاندار کنند و آن ها را برای شناسایی آنتی ژن ها در بافت به کار ببرند. این کشف یک انقلاب در ایمونولوژی و آسیب شناسی ایجاد کرد، زیرا برای اولین بار امکان مشاهده ی مستقیم واکنش آنتی ژن–آنتی بادی در بافت فراهم شد.
در دهه های بعد، با پیشرفت میکروسکوپ های فلورسنت و تولید رنگ های فلورسنت پایدارتر مانند FITC (فلورسئین ایزوتیوسیانات) و Rhodamine، دقت و حساسیت این روش افزایش یافت. امروزه DIF یکی از روش های استاندارد در تشخیص بیماری های پوستی خودایمنی، بیماری های کلیوی و برخی عفونت ها محسوب می شود.

مبنای علمی روش

ایمونوفلورسانس مستقیم بر اساس سه اصل علمی بنا شده است:
اختصاصیت واکنش آنتی ژن–آنتی بادی
قابلیت نشاندارسازی آنتی بادی با فلوروکروم
توانایی میکروسکوپ فلورسنت در تحریک و آشکارسازی نور ساطع شده
فلوروکروم ها (Fluorochromes) مولکول هایی هستند که در طول موج خاصی از نور تحریک می شوند و سپس در طول موج بلندتری نور منتشر می کنند. به عنوان مثال، FITC در نور آبی تحریک شده و نور سبز منتشر می کند.

روش انجام (توضیح علمی مرحله به مرحله)

نمونه برداری
در بیماری های پوستی معمولاً بیوپسی پوستی تازه گرفته می شود. نمونه باید در محیط مخصوص نگهداری مانند Michel’s transport medium یا در شرایط انجماد سریع (فریز) نگهداری شود، زیرا فرمالین باعث تخریب آنتی ژن های سطحی می شود و برای DIF مناسب نیست.
آماده سازی برش بافتی
نمونه در دستگاه کرایواستات (Cryostat) در دمای حدود منفی 20 درجه سانتی گراد برش داده می شود. برش های نازک (حدود 4 تا 6 میکرومتر) تهیه و روی لام شیشه ای مخصوص قرار داده می شوند.
فیکساسیون
معمولاً با استون سرد به مدت کوتاه فیکس می شوند تا ساختار پروتئینی حفظ شود و آنتی ژن ها در دسترس باقی بمانند.
افزودن آنتی بادی فلورسنت
آنتی بادی نشاندار شده با فلوروکروم (مثلاً Anti-IgG-FITC یا Anti-C3-FITC) روی برش بافتی اضافه می شود. این آنتی بادی ها به طور اختصاصی به ایمونوگلوبولین ها یا اجزای کمپلمان رسوب کرده در بافت متصل می شوند.
انکوباسیون
لام ها در دمای مناسب (معمولاً اتاق یا 37 درجه سانتی گراد بسته به پروتکل) برای مدت مشخص انکوبه می شوند تا اتصال کامل صورت گیرد.
شستشو
برای حذف آنتی بادی های غیرمتصل، نمونه با بافر فسفات سالین (PBS) شسته می شود.
مشاهده با میکروسکوپ فلورسنت
لام ها زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی می شوند. الگوی فلورسانس (خطی، گرانولار، شبکه ای و غیره) و محل آن (درم، اپیدرم، غشای پایه، گلومرول کلیه) ثبت و تفسیر می شود.

کاربردهای ایمونوفلورسانس مستقیم

تشخیص بیماری های خودایمنی پوستی

مهم ترین کاربرد DIF در تشخیص بیماری هایی مانند:

پمفیگوس ولگاریس
پمفیگوئید بولوز
درماتیت هرپتی فرمیس
لوپوس اریتماتوز سیستمیک و پوستی
در این بیماری ها الگوهای رسوب ایمونوگلوبولین ها و کمپلمان در محل های خاص دیده می شود.
بیماری های کلیوی
در بیوپسی کلیه، DIF برای بررسی رسوب IgG، IgA، IgM و C3 در گلومرول ها استفاده می شود. در نفروپاتی IgA رسوب مزانژیال IgA دیده می شود. در گلومرولونفریت های مختلف الگوهای متفاوتی وجود دارد.
تشخیص برخی عفونت ها
در برخی عفونت های ویروسی یا باکتریایی، می توان آنتی ژن های خاص را مستقیماً در بافت شناسایی کرد.
بررسی واسکولیت ها
رسوب کمپلکس های ایمنی در دیواره عروق کوچک قابل مشاهده است.

نتایج و تفسیر

نتایج DIF بر اساس موارد زیر گزارش می شوند:
نوع ایمونوگلوبولین یا کمپلمان (IgG، IgA، IgM، C3 و غیره)
شدت فلورسانس (ضعیف، متوسط، شدید)
الگوی توزیع (خطی، گرانولار، شبکه ای)
محل رسوب (غشای پایه، بین سلولی، مزانژیال و غیره)
مثلاً در پمفیگوس ولگاریس، فلورسانس بین سلولی به صورت شبکه ای در اپیدرم دیده می شود. در پمفیگوئید بولوز، الگوی خطی در امتداد غشای پایه مشاهده می شود.

محدوده فعالیت این روش
DIF در آزمایشگاه های تخصصی پاتولوژی، ایمونولوژی و نفرولوژی انجام می شود. این روش نیازمند تجهیزات زیر است:
کرایواستات برای برش بافت منجمد
میکروسکوپ فلورسنت پیشرفته
آنتی بادی های نشاندار استاندارد
تکنسین و پاتولوژیست آموزش دیده
به دلیل نیاز به نمونه تازه، این آزمایش باید در مراکزی انجام شود که امکان انتقال سریع و نگهداری مناسب نمونه را دارند. همچنین تفسیر نتایج وابسته به تجربه متخصص است.
تفاوت با ایمونوفلورسانس غیرمستقیم
در روش مستقیم، آنتی بادی نشاندار مستقیماً به آنتی ژن بافتی متصل می شود. اما در روش غیرمستقیم، ابتدا آنتی بادی اولیه بدون فلورسنت به آنتی ژن متصل شده و سپس یک آنتی بادی ثانویه نشاندار به آن متصل می شود. روش غیرمستقیم حساسیت بیشتری دارد ولی DIF برای مشاهده رسوبات درون بافت استانداردتر است.

مزایا

اختصاصیت بالا
مشاهده مستقیم در محل بافت
امکان تعیین الگوی دقیق رسوب
سرعت نسبتاً مناسب

محدودیت ها

نیاز به نمونه تازه
وابستگی به کیفیت آنتی بادی
احتمال فلورسانس زمینه ای
نیاز به تجهیزات تخصصی