عنوان فارسی: طراحی پرایمر برای LAMP
عنوان انگلیسی:
تعریف یک خطی:کلمات کلیدی (در ابتدای مطلب):
طراحی پرایمر برای LAMP چیست
طراحی پرایمر برای LAMP یک تکنیک پیشرفته در زیست شناسی مولکولی است که امکان تکثیر DNA یا RNA با بازده بسیار بالا و بدون نیاز به چرخه های حرارتی PCR را فراهم می کند. LAMP از واکنش تک دما استفاده می کند و به کمک چهار تا شش پرایمر که بخش های مختلف یک توالی هدف را شناسایی می کنند، محصولی بزرگ و منشعب ایجاد می شود.
پرایمرهای LAMP شامل چهار پرایمر اصلی (F3، B3، FIP و BIP) و دو پرایمر کمکی حلقوی (Loop-F و Loop-B) هستند که به طور همزمان و هماهنگ توالی هدف را تکثیر می کنند. این طراحی باعث می شود واکنش بسیار سریع انجام شود و توانایی تشخیص توالی های کم وفراوان را داشته باشد.
به زبان ساده، پرایمرهای LAMP مانند یک مجموعه کلید و دستیار هستند؛ پرایمرهای اصلی تکثیر را آغاز می کنند و پرایمرهای حلقوی سرعت و حجم محصول را افزایش می دهند، بنابراین می توان نتایج تشخیصی را در کمتر از یک ساعت مشاهده کرد.
تعریف علمی طراحی پرایمر برای LAMP
از منظر علمی، طراحی پرایمر برای LAMP شامل مراحل زیر است:
انتخاب ناحیه هدف اختصاصی با طول ۲۰۰–۳۰۰ جفت باز برای تکثیر پایدار.
طراحی چهار پرایمر اصلی (F3، B3، FIP و BIP) که توالی هدف را به طور اختصاصی شناسایی می کنند.
طراحی دو پرایمر حلقوی (Loop-F و Loop-B) برای افزایش سرعت و بازده واکنش.
تنظیم Tm پرایمرها: F3 و B3 حدود ۵۸–۶۰°C، FIP و BIP حدود ۶۰–۶۵°C و Loop ها مشابه FIP/BIP.
تنظیم درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ برای اتصال پایدار و اختصاصی.
بررسی ساختارهای ثانویه و Self-dimer یا Hairpin برای جلوگیری از کاهش بازده.
محاسبه Tm پرایمرها معمولاً با فرمول Nearest-Neighbor انجام می شود:
Tm = ΔH / (ΔS + R × ln[C/4]) – 273.15 + 16.6 × log[Na+]
که ΔH و ΔS انرژی های آنتالپی و آنتروپی اتصال، C غلظت پرایمر و [Na+] غلظت یون سدیم محیط واکنش است.
تاریخچه طراحی پرایمر برای LAMP
روش LAMP برای اولین بار در سال ۲۰۰۰ توسط Notomi و همکاران معرفی شد. هدف از توسعه این تکنیک، ارائه یک روش تکثیر سریع، اختصاصی و بدون نیاز به دستگاه های PCR بود. با معرفی LAMP، امکان تشخیص سریع ویروس ها، باکتری ها و ژن های مهم در آزمایشگاه های بالینی و حتی محیط های میدانی فراهم شد.
در دهه ۲۰۱۰، LAMP به طور گسترده در تشخیص ویروس های بیماری زا مانند SARS-CoV-2، Influenza و ویروس های هپاتیت، همچنین در تشخیص باکتری های مقاوم به دارو مورد استفاده قرار گرفت.
محدوده فعالیت طراحی پرایمر برای LAMP
پرایمرهای LAMP در حوزه های زیر کاربرد دارند:
تشخیص سریع ویروس ها و باکتری ها حتی در نمونه های با تعداد کم DNA/RNA.
تشخیص در محیط های میدانی و کم تجهیزات به دلیل تک دما بودن واکنش.
شناسایی ژن های مقاومت به دارو و جهش های مهم با اختصاصیت بالا.
اندازه گیری و تعیین کمیت تقریبی ژن ها در نمونه های کلینیکی و تحقیقاتی.
کنترل کیفیت و شناسایی آلاینده ها در صنایع غذایی و دارویی.
روش انجام طراحی پرایمر برای LAMP به صورت علمی
1. انتخاب ناحیه هدف
انتخاب یک توالی اختصاصی ۲۰۰–۳۰۰ جفت باز برای تضمین اتصال و تکثیر پایدار.
2. طراحی پرایمرهای اصلی
F3 و B3: طول ۱۸–۲۵ نوکلئوتید، Tm حدود ۵۸–۶۰°C، درصد GC ۴۰–۶۰٪
FIP و BIP: ترکیب دو بخش مکمل، طول کلی ۳۸–۴۵ نوکلئوتید، Tm حدود ۶۰–۶۵°C
3. طراحی پرایمرهای حلقوی
Loop-F و Loop-B: طول ۱۸–۲۵ نوکلئوتید، Tm مشابه FIP/BIP، افزایش سرعت واکنش و حجم محصول
4. بررسی ساختار ثانویه و اختصاصیت
حذف Hairpin و Self-dimer
بررسی اختصاصیت با BLAST و Primer-BLAST
5. اعتبارسنجی تجربی
اجرای واکنش LAMP در دمای ثابت (۶۰–۶۵°C)
مشاهده محصول با فلورسانس یا رنگ های متابولیک
رسم نمودار زمان تا سیگنال مثبت (Time to Positivity)
مثال های کاربردی واقعی
تشخیص SARS-CoV-2 با LAMP: پرایمرهای FIP/BIP و Loop برای ژن N طراحی شدند و واکنش کمتر از ۳۰ دقیقه سیگنال مثبت ارائه کرد.
تشخیص Influenza A و B: پرایمرهای اختصاصی LAMP با آمپلیکون ۲۵۰ جفت باز توانستند ویروس های موجود در نمونه های کلینیکی را با دقت بالا شناسایی کنند.
تشخیص باکتری مقاوم به دارو (MRSA): پرایمرهای LAMP برای ژن mecA طراحی شدند و امکان تشخیص سریع در محیط آزمایشگاهی و میدانی فراهم شد.
نتایج و مزایای استفاده از طراحی پرایمر برای LAMP
اختصاصیت بالا به دلیل استفاده از ۴–۶ پرایمر اختصاصی
سرعت بالای واکنش (نتایج در کمتر از ۱ ساعت)
عدم نیاز به چرخه های حرارتی PCR و تجهیزات پیچیده
توانایی تشخیص توالی های کم وفراوان حتی در نمونه های محدود
کاربرد گسترده در تشخیص ویروسی، باکتریایی و اپیدمیولوژی
محدودیت ها و چالش ها
طراحی پیچیده پرایمرها نسبت به PCR سنتی
احتمال تولید محصولات غیر اختصاصی در صورت طراحی نامناسب
نیاز به بهینه سازی دقیق دما و غلظت نمک
عدم امکان اندازه گیری دقیق کمیت DNA/RNA بدون استفاده از فلورسانس و استاندارد