تکنیک فلورسانس حل شده در زمان

تکنیک فلورسانس حل شده در زمان چیست؟

فلورسانس زمان حل شونده یا Time-Resolved Fluorescence Immunoassay (TRFIA) یک تکنیک پیشرفته و حساس در بیوشیمی و ایمونولوژی است که برای اندازه گیری دقیق مولکول ها، پروتئین ها، آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در نمونه های بیولوژیک استفاده می شود. این روش ترکیبی از اصول ایمونواسی و فلورسانس است و تفاوت اصلی آن با فلورسانس معمولی در این است که سیگنال فلورسانس پس از گذشت یک زمان مشخص (زمان حل شدن یا Decay Time) اندازه گیری می شود. این ویژگی باعث می شود که پس زمینه ناشی از خودفلورسانس نمونه ها یا تداخل نوری کاهش یافته و حساسیت و دقت اندازه گیری به طرز چشمگیری افزایش یابد. TRFIA به ویژه در تشخیص بیماری ها، اندازه گیری هورمون ها، آنالیز پروتئین ها و کاربردهای تحقیقاتی مولکولی و بالینی اهمیت دارد.

تعریف ساده تکنیک فلورسانس حل شده در زمان

فلورسانس زمان حل شونده یک روش آزمایشگاهی است که با استفاده از برچسب های فلورسانس با طول عمر طولانی، امکان اندازه گیری دقیق و حساس پروتئین ها، آنتی ژن ها و مولکول ها در نمونه های زیستی را فراهم می کند و اثر سیگنال های پس زمینه را کاهش می دهد.

توضیح به زبان ساده تکنیک فلورسانس حل شده در زمان

تصور کنید می خواهید نور بسیار ضعیفی را از یک پروتئین خاص در یک نمونه پیچیده بسنجید. در فلورسانس معمولی، سیگنال پس زمینه از سایر مولکول ها و خودنمونه می تواند مانع تشخیص دقیق شود. TRFIA با استفاده از فلوروفورهایی که نور آن ها تا چند میکروثانیه یا میلی ثانیه پس از تابش باقی می ماند، اجازه می دهد که تنها سیگنال فلورسانس مولکول هدف اندازه گیری شود. به بیان ساده، پس از تابش نور به نمونه، سیستم چند لحظه صبر می کند و سپس فقط نور با طول عمر طولانی ثبت می شود، در نتیجه نویز و سیگنال های ناخواسته حذف می شوند و داده ها بسیار دقیق تر هستند.

تاریخچه TRFIA

ریشه های فلورسانس زمان حل شونده به دهه 1960 و 1970 برمی گردد، زمانی که محققان شروع به استفاده از لانتی نیدها (Lanthanides) مانند اروپیوم، تربیوم و ساماریوم کردند. این یون ها به دلیل طول عمر فلورسانس بسیار طولانی و تابش نوری پایدار، برای تشخیص های حساس و کاهش پس زمینه بسیار مناسب بودند.

در دهه 1980، روش TRFIA به شکل عملی و تجاری درآمد و برای اولین بار در اندازه گیری هورمون ها، پروتئین های سرمی و آزمایش های بالینی استفاده شد. توسعه میکروسکوپ ها و دستگاه های خوانش فلورسانس با قابلیت زمان حل شدن نیز باعث شد حساسیت این روش به حد نانوگرم و حتی پایین تر برسد. امروزه TRFIA در تحقیقات مولکولی، بالینی و داروسازی به عنوان یک استاندارد برای آزمایش های دقیق و حساس شناخته می شود.

مبنای علمی روش

TRFIA بر چند اصل علمی کلیدی استوار است:

واکنش اختصاصی آنتی ژن-آنتی بادی
آنتی بادی ها یا گیرنده های اختصاصی به آنتی ژن هدف متصل می شوند. این اتصال بسیار خاص است و امکان شناسایی دقیق مولکول ها را فراهم می کند.

نشاندار کردن مولکول ها با فلوروفورهای زمان حل شونده
فلوروفورهای مورد استفاده معمولاً یون های لانتی نید هستند که پس از تحریک با نور، مدت طولانی تری نور ساطع می کنند (در محدوده میکروثانیه تا میلی ثانیه). این ویژگی باعث حذف اثر پس زمینه و سیگنال های ناخواسته می شود.

اندازه گیری زمان حل شدن نور فلورسانس
در TRFIA، سیگنال فلورسانس پس از یک فاصله زمانی مشخص پس از تحریک نور ثبت می شود. تنها نور ساطع شده از فلوروفورهای زمان حل شونده اندازه گیری می شود، بنابراین دقت و حساسیت افزایش می یابد.

روش انجام (شرح علمی مرحله به مرحله)

آماده سازی نمونه
نمونه ها می توانند سرم، پلاسمای خون، ادرار، سلول های کشت شده یا سایر مایعات بیولوژیک باشند. نمونه ها معمولاً رقیق و آماده شده تا حجم و غلظت آنتی ژن ها قابل کنترل باشد.

پوشش دهی سطوح با گیرنده یا آنتی بادی اولیه
در یک پلیت (مانند میکروتیتر) یا سطح جامد، آنتی بادی اولیه یا گیرنده اختصاصی برای اتصال آنتی ژن ها قرار داده می شود. این مرحله باعث جذب مولکول هدف روی سطح می شود.

شستشو و حذف مولکول های غیرمتصل
پس از اتصال، نمونه ها با بافر شسته می شوند تا مولکول ها و آنتی بادی های غیرمتصل حذف شوند.

افزودن آنتی بادی ثانویه نشاندار با فلوروفور زمان حل شونده
آنتی بادی ثانویه که به یون های اروپیوم، تربیوم یا سایر فلوروفورهای زمان حل شونده متصل است، اضافه می شود و به آنتی ژن یا آنتی بادی اولیه متصل می گردد.

انکوباسیون و شستشوی مجدد
نمونه ها برای مدت مشخصی در دمای مناسب انکوبه می شوند و سپس شسته می شوند تا سیگنال های غیرمتصل حذف شوند.

خوانش فلورسانس زمان حل شونده
نمونه ها با دستگاه های خوانش TRFIA تحریک می شوند و پس از یک زمان تأخیر مشخص، نور فلورسانس ثبت می شود. این فاصله زمانی باعث کاهش پس زمینه و افزایش حساسیت می شود.

تحلیل داده ها
شدت فلورسانس ثبت شده با منحنی استاندارد مقایسه می شود و میزان آنتی ژن یا مولکول هدف محاسبه می شود.

کاربردهای Time-Resolved Fluorescence Immunoassay

اندازه گیری هورمون ها
TRFIA برای سنجش دقیق هورمون هایی مانند هورمون رشد، تستوسترون، LH و FSH در سرم یا پلاسمای خون استفاده می شود.

تشخیص بیماری ها
قابلیت تشخیص بسیار حساس آنتی ژن ها و آنتی بادی های بیماری زا در نمونه های بالینی مانند ویروس ها، باکتری ها و پروتئین های سرطان.

تحقیقات دارویی و پروتئومیک
ارزیابی میزان پروتئین ها و تغییرات مولکولی در اثر داروها یا شرایط تجربی.

تعیین مولکول های سیگنالینگ سلولی
مشاهده پروتئین ها و مولکول های سیگنالینگ در مسیرهای سلولی پیچیده.

آنالیز حساس نمونه های پیچیده
به دلیل کاهش پس زمینه، TRFIA برای نمونه های با ماتریس پیچیده مانند سرم، ادرار یا سلول های کشت شده ایده آل است.

نتایج و تفسیر

نتایج TRFIA معمولاً بر اساس شدت فلورسانس ثبت شده تحلیل می شوند:

مثبت یا منفی بودن
وجود سیگنال فلورسانس زمان حل شونده نشان دهنده حضور مولکول هدف است.

شدت فلورسانس
شدت نور فلورسانس نشان دهنده مقدار تقریبی آنتی ژن یا پروتئین هدف است و می تواند برای تحلیل کمی استفاده شود.

مقایسه با استاندارد
شدت فلورسانس نمونه ها با منحنی استاندارد مقایسه می شود تا میزان دقیق مولکول هدف محاسبه گردد.

حساسیت و دقت بالا
به دلیل زمان حل شدن فلورسانس، اثر پس زمینه و تداخلات نوری حذف شده و داده ها بسیار قابل اعتماد هستند.

محدوده فعالیت

TRFIA در آزمایشگاه های تحقیقاتی، بالینی و بیوشیمی انجام می شود. تجهیزات مورد نیاز شامل:

دستگاه خوانش فلورسانس زمان حل شونده (TRF Reader)

پلیت های میکروتیتر یا سطوح جامد پوشش دهی شده

آنتی بادی های اولیه و ثانویه نشاندار با یون های لانتی نید

بافرهای شستشو و محلول های مسدودکننده

نرم افزارهای تحلیل داده و منحنی استاندارد

مزایا

حساسیت بسیار بالا و کاهش پس زمینه

امکان اندازه گیری مولکول ها در نمونه های پیچیده

قابلیت تحلیل کمی دقیق

مناسب برای تشخیص های بالینی و تحقیقات مولکولی

اندازه گیری چندین نشانگر به صورت همزمان با فلوروفورهای مختلف

محدودیت ها

نیاز به تجهیزات تخصصی و گران قیمت

نیاز به مهارت در آماده سازی نمونه ها و تحلیل داده ها

محدودیت در انتخاب فلوروفورهای زمان حل شونده

زمان بر بودن آماده سازی و انکوباسیون نمونه ها