Amphotericin B چیست؟
Amphotericin B یک ترکیب ضدقارچی از گروه polyene antifungal agents است که در بسیاری از سیستم های کشت سلولی برای کاهش خطر آلودگی قارچی و مخمری مورد استفاده قرار می گیرد. اگرچه در محیط آزمایشگاهی معمولاً در کنار واژه هایی مانند «آنتی بیوتیک» یا «آنتی مایکوتیک» معرفی می شود، از نظر فارماکولوژیک یک آنتی بیوتیک ضدباکتریایی کلاسیک محسوب نمی شود، بلکه یک عامل ضدقارچ است که مکانیسم اثر آن عمدتاً بر اساس برهم کنش با استرول های غشای سلولی قارچ ها شکل می گیرد.
این ماده در کشت سلول بیشتر با هدف پیشگیری یا کنترل آلودگی ناشی از قارچ ها و مخمرها به محیط کشت افزوده می شود. آلودگی قارچی می تواند به سرعت موجب تغییر رنگ محیط، ایجاد ذرات و رشته های قابل مشاهده، تغییر pH، کاهش کیفیت مورفولوژی سلول ها و در نهایت از بین رفتن کل کشت شود. به همین دلیل در برخی فرایندهای تحقیقاتی، استفاده از یک ترکیب ضدقارچ به عنوان بخشی از استراتژی کنترل آلودگی در نظر گرفته می شود.
با این حال، وجود این ماده در محیط کشت به معنی استریل شدن محیط یا مصونیت کامل کشت در برابر آلودگی نیست و استفاده مداوم یا غیراصولی از آن می تواند مشکلات خاص خود را ایجاد کند.
چرا کنترل آلودگی قارچی در کشت سلولی اهمیت دارد؟
قارچ ها و مخمرها از جمله آلاینده هایی هستند که می توانند در محیط های غنی مورد استفاده برای رشد سلول های پستانداران به خوبی تکثیر شوند. وجود گلوکز، آمینواسیدها، ویتامین ها، نمک ها و سایر ترکیبات مغذی در محیط کشت شرایط مناسبی را برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم ها فراهم می کند و همین ویژگی، محیط کشت را در صورت ورود یک عامل آلوده کننده به بستری مناسب برای تکثیر تبدیل می کند.
آلودگی قارچی در بسیاری از موارد برخلاف برخی آلودگی های باکتریایی نسبتاً سریع قابل تشخیص است، زیرا رشد مخمر ممکن است به شکل ذرات یا توده های سلولی و رشد کپک ها به صورت ساختارهای رشته ای یا پنبه ای مشاهده شود. با وجود این، تشخیص ظاهری تنها زمانی قابل اعتماد است که آلودگی به مرحله ای رسیده باشد که از نظر مورفولوژیک قابل مشاهده باشد؛ بنابراین ممکن است در مراحل اولیه، آلودگی بدون نشانه واضح باقی بماند.
قارچ یا مخمر آلوده کننده علاوه بر مصرف مواد غذایی موجود در محیط، می تواند متابولیت هایی تولید کند که شرایط فیزیکوشیمیایی محیط را تغییر داده و به سلول های کشت شده آسیب برسانند. بنابراین کنترل آلودگی قارچی بخشی از کنترل کیفیت کشت سلولی محسوب می شود و نباید صرفاً به مشاهده روزانه فلاکس ها محدود شود.
تفاوت عوامل ضدقارچ با آنتی بیوتیک های ضدباکتریایی
یکی از نکات مهم در استفاده از مواد ضدمیکروبی در کشت سلول، تفکیک عملکرد عوامل ضدباکتریایی از عوامل ضدقارچی است. ترکیباتی مانند Penicillin و Streptomycin عمدتاً برای کنترل طیفی از باکتری های حساس مورد استفاده قرار می گیرند، در حالی که ترکیباتی مانند Amphotericin B با هدف مهار قارچ ها و مخمرها طراحی شده اند.
این تفاوت از مکانیسم اثر ناشی می شود. سلول های قارچی دارای غشایی هستند که در آن ergosterol یکی از استرول های مهم ساختاری محسوب می شود، در حالی که غشای سلول های پستانداران عمدتاً حاوی cholesterol است. این تفاوت در ترکیب غشایی، اساس انتخاب پذیری نسبی بسیاری از داروهای ضدقارچ را ایجاد می کند.
در نتیجه، افزودن یک آنتی بیوتیک ضدباکتریایی به محیط کشت الزاماً از رشد قارچ یا مخمر جلوگیری نمی کند. به همین دلیل در برخی فرمولاسیون های تجاری، ترکیبات ضدباکتریایی و ضدقارچی به صورت جداگانه یا در قالب ترکیبات چندگانه عرضه می شوند تا طیف وسیع تری از آلاینده های احتمالی تحت کنترل قرار گیرند.
مکانیسم اثر بر غشای سلول قارچی
مکانیسم اثر اصلی این ترکیب به توانایی آن در اتصال به استرول های موجود در غشای قارچ، به ویژه ergosterol، مربوط است. پس از برهم کنش با این استرول ها، ساختار غشایی دچار اختلال می شود و نفوذپذیری غشاء افزایش پیدا می کند. این تغییر می تواند موجب خروج یون ها و مولکول های ضروری از سلول و در نهایت از دست رفتن تعادل یونی و متابولیکی شود.
در غلظت های مؤثر، ایجاد اختلال در یکپارچگی غشاء می تواند برای سلول قارچی کشنده باشد. همین ویژگی، این ترکیب را از بسیاری از آنتی بیوتیک های ضدباکتریایی که بر دیواره سلولی یا ریبوزوم باکتری ها اثر می گذارند، متمایز می کند.
البته مکانیسم دقیق اثر و میزان سمیت به غلظت، مدت تماس، نوع قارچ، ترکیب محیط و شرایط سیستم کشت وابسته است. بنابراین نمی توان صرفاً بر اساس وجود ماده ضدقارچ در محیط نتیجه گرفت که تمام گونه های قارچی به یک اندازه حساس خواهند بود.
طیف اثر و میکروارگانیسم های حساس
این ماده عمدتاً علیه طیفی از قارچ ها و مخمرها فعالیت دارد و به همین دلیل در محیط های کشت سلولی برای کاهش احتمال رشد این گروه از آلاینده ها مورد استفاده قرار می گیرد. با این حال، حساسیت میکروارگانیسم ها یکسان نیست و گونه، وضعیت فیزیولوژیک، تراکم آلودگی و مدت تماس می توانند بر نتیجه تأثیر داشته باشند.
در کاربردهای آزمایشگاهی، هدف اصلی معمولاً جلوگیری از استقرار و تکثیر آلودگی در محیط کشت است، نه درمان یک کشت سلولی به شدت آلوده. اگر آلودگی قارچی قابل مشاهده در یک فلاکس وجود داشته باشد، افزایش غلظت ماده ضدقارچ الزاماً راهکار مناسبی برای نجات کشت محسوب نمی شود، زیرا آلودگی شدید ممکن است قبلاً اثرات برگشت ناپذیری بر سلول ها و محیط گذاشته باشد.
همچنین نباید از این ماده انتظار داشت که تمام گونه های قارچی، مخمرها یا سایر میکروارگانیسم های یوکاریوتی را تحت کنترل قرار دهد. برای شناسایی دقیق عامل آلودگی، در صورت اهمیت پروژه، بررسی میکروبیولوژیک مناسب و شناسایی آلاینده ارزش بیشتری از افزایش خودسرانه غلظت دارد.
غلظت استاندارد در کشت سلول
یکی از رایج ترین فرمولاسیون های تجاری، محلول های استوک با غلظت مشخص است که برای اضافه شدن به محیط کشت طراحی شده اند. در محصولات تجاری ممکن است غلظت های مختلفی وجود داشته باشد و به همین دلیل، تعیین مقدار مصرف باید بر اساس اطلاعات درج شده در Certificate of Analysis، Product Datasheet یا دستورالعمل سازنده انجام شود.
در بسیاری از سیستم های کشت سلول، غلظت نهایی مورد استفاده برای Amphotericin B در محدوده چند میکروگرم بر میلی لیتر قرار دارد و یکی از غلظت های رایج نهایی حدود 2.5 µg/mL است؛ با این حال این مقدار یک قانون عمومی برای تمام سلول ها و تمام محصولات تجاری نیست. برخی فرمولاسیون ها به گونه ای طراحی شده اند که با نسبت مشخصی به محیط افزوده شوند و غلظت نهایی متفاوتی ایجاد کنند.
بنابراین نباید صرفاً بر اساس نام ماده، یک حجم ثابت برای همه محصولات در نظر گرفت. محاسبه باید از روی غلظت واقعی محلول استوک انجام شود. برای مثال، اگر استوک 250 µg/mL باشد و غلظت نهایی هدف 2.5 µg/mL تعیین شده باشد، حجم مورد نیاز از رابطه C1V1=C2V2 به دست می آید.
مفهوم محلول استوک و رقت نهایی
در آزمایشگاه معمولاً ماده ضدقارچ به صورت محلول استوک غلیظ تر نگهداری می شود تا بتوان مقدار مشخصی از آن را به محیط اضافه کرد و غلظت نهایی مورد نیاز را ایجاد نمود. این رویکرد از نظر عملی باعث می شود تهیه محیط ها سریع تر انجام شود و خطای توزین مقادیر بسیار کم ماده کاهش پیدا کند.
برای مثال، اگر حجم نهایی محیط 100 میلی لیتر باشد و غلظت استوک 250 µg/mL و غلظت نهایی هدف 2.5 µg/mL باشد، حجم استوک مورد نیاز 1 میلی لیتر خواهد بود. نکته مهم این است که مقدار نهایی همیشه باید بر اساس غلظت واقعی محصول محاسبه شود و نمی توان صرفاً از یک نسبت ثابت برای تمام برندها استفاده کرد.
در هنگام رقیق سازی، باید به استریل بودن محلول و محیط نیز توجه شود. ورود آلودگی در زمان افزودن مکمل می تواند تمام تلاش های انجام شده برای کنترل آلودگی را بی اثر کند و حتی خود محلول مکمل را به منبع آلودگی تبدیل نماید.
اثر بر سلول های پستانداران
یکی از مهم ترین ملاحظات استفاده از عوامل ضدقارچ در کشت سلولی، احتمال اثرات ناخواسته بر سلول های یوکاریوتی است. اگرچه هدف اصلی ترکیب، تعامل با ergosterol موجود در غشای قارچ است، سلول های پستانداران نیز دارای استرول های غشایی، به خصوص cholesterol، هستند و در غلظت ها و شرایط خاص ممکن است نسبت به این ترکیب حساسیت نشان دهند.
شدت این اثرات به نوع سلول، تراکم سلولی، مدت تماس، غلظت مصرفی، ترکیب محیط و وضعیت فیزیولوژیک سلول وابسته است. برخی سلول ها ممکن است در غلظت های متداول به خوبی رشد کنند، در حالی که سلول های حساس تر ممکن است کاهش رشد، تغییر مورفولوژی یا کاهش viability نشان دهند.
به همین دلیل، استفاده از بالاترین غلظت ممکن راهکار مناسبی برای کنترل آلودگی نیست. در یک سیستم کشت استاندارد، هدف باید استفاده از کمترین غلظت مؤثر و معتبرشده باشد که کنترل قابل قبول آلودگی قارچی را فراهم کند و در عین حال کمترین اثر منفی را بر سلول ایجاد نماید.
اثر استفاده طولانی مدت بر کیفیت کشت
استفاده مداوم از ترکیبات ضدمیکروبی ممکن است از نظر طراحی آزمایش اهمیت داشته باشد، زیرا هر ماده ای که به محیط کشت افزوده می شود، می تواند بخشی از شرایط فیزیولوژیک سیستم را تغییر دهد. حتی اگر تغییرات شدید در viability مشاهده نشود، احتمال تغییر در متابولیسم سلولی، مسیرهای استرس، رشد و پاسخ به برخی تیمارها وجود دارد.
این موضوع به ویژه در مطالعاتی که هدف آن ها بررسی دقیق پاسخ سلولی به یک دارو، ترکیب شیمیایی، استرس محیطی یا مسیر مولکولی است، اهمیت بیشتری پیدا می کند. در چنین آزمایش هایی بهتر است شرایط مربوط به حضور یا عدم حضور عوامل ضدمیکروبی بین گروه های آزمایشی استاندارد و کنترل شده باشد.
در مطالعات طولانی مدت نیز بهتر است استفاده از ماده ضدقارچ به صورت بخشی از یک استراتژی کنترل آلودگی تعریف شود، نه اینکه جایگزین پایش منظم کشت، بررسی مورفولوژی، کنترل شرایط انکوباسیون و تست های دوره ای آلودگی شود.
آیا برای کنترل مایکوپلاسما مؤثر است؟
یکی از اشتباهات رایج در کشت سلول این است که تصور شود یک ترکیب ضدقارچ می تواند از تمام آلودگی های میکروبی جلوگیری کند. مایکوپلاسما یک گروه مهم از آلاینده های کشت سلولی است که ویژگی های زیستی متفاوتی از قارچ ها و بسیاری از باکتری های معمول دارد.
به همین دلیل، استفاده از Amphotericin B جایگزینی برای Mycoplasma Testing محسوب نمی شود. حتی استفاده هم زمان از آنتی بیوتیک های ضدباکتریایی نیز به معنی حذف نیاز به پایش مایکوپلاسما نیست.
مایکوپلاسما می تواند بدون ایجاد کدورت واضح در محیط، برای مدت طولانی در کشت باقی بماند و با تغییر متابولیسم سلولی، سرعت رشد، بیان ژن و پاسخ های فیزیولوژیک، نتایج آزمایش را تحت تأثیر قرار دهد. بنابراین کنترل آن نیازمند روش های اختصاصی تشخیص مانند روش های مولکولی، رنگ آمیزی یا کیت های معتبر تشخیصی است.
استفاده در کنار Penicillin و Streptomycin
در بسیاری از آزمایشگاه ها، ترکیبات ضدقارچ در کنار Penicillin و Streptomycin استفاده می شوند تا پوشش ضدباکتریایی و ضدقارچی به صورت هم زمان ایجاد شود. در چنین شرایطی باید توجه داشت که هر یک از اجزای این ترکیب، هدف و مکانیسم اثر متفاوتی دارد و حضور هم زمان آن ها به معنای حذف کامل خطر آلودگی نیست.
Penicillin عمدتاً بر سنتز دیواره سلولی باکتری های حساس اثر می گذارد و Streptomycin با ریبوزوم باکتریایی تعامل دارد، در حالی که عامل ضدقارچ بر غشای سلول قارچی اثر می کند. بنابراین این مواد از نظر مکانیسم مکمل یکدیگر هستند، اما نباید آن ها را یک ماده واحد با عملکرد یکسان در نظر گرفت.
همچنین استفاده هم زمان چند عامل ضدمیکروبی باید بر اساس نیاز واقعی سیستم، دستورالعمل محصول و طراحی آزمایش انجام شود؛ زیرا افزایش تعداد مواد ضد میکروبی الزاماً به معنای افزایش کیفیت کشت نیست.
کاربرد پس از ذوب سلول های فریز شده
پس از thaw کردن سلول های فریز شده، سلول ها معمولاً در شرایطی قرار دارند که نسبت به استرس های محیطی حساس تر هستند. در این مرحله ممکن است استفاده از محیط کامل حاوی مکمل های مورد نیاز رشد انجام شود، اما افزودن عوامل ضدمیکروبی باید با توجه به پروتکل اختصاصی سلول و نوع مطالعه صورت گیرد.
وجود ماده ضدقارچ می تواند احتمال رشد برخی آلاینده های قارچی را کاهش دهد، اما نباید از آن به عنوان راهی برای جبران تکنیک آسپتیک ضعیف استفاده کرد. اگر سلول ها از ابتدا با یک آلودگی قارچی وارد سیستم شده باشند، وجود ماده ضدمیکروبی ممکن است رشد ظاهری را کاهش دهد، بدون اینکه الزاماً آلودگی را به طور کامل حذف کند.
برای همین، استفاده از یک پروتکل ثابت و معتبر برای thawing، شست وشو، تعویض محیط و پایش مورفولوژی اهمیت زیادی دارد.
تأثیر بر آزمون های viability مانند MTT
در آزمایش هایی مانند MTT، XTT، Resazurin و سایر آزمون های مبتنی بر فعالیت متابولیکی سلول، شرایط محیطی باید بین گروه های مختلف تا حد امکان یکسان باشد. هر ترکیب خارجی که بر متابولیسم یا وضعیت فیزیولوژیک سلول اثر بگذارد، از نظر تئوری می تواند بر سیگنال نهایی آزمایش تأثیر داشته باشد.
در نتیجه، اگر گروه کنترل بدون ماده ضدقارچ و گروه آزمایشی همراه با آن باشد، اختلاف مشاهده شده الزاماً فقط ناشی از تیمار اصلی نخواهد بود. برای کاهش این مشکل، شرایط کشت، زمان تماس و حضور مکمل ها باید در گروه های مقایسه ای به شکل کنترل شده طراحی شوند.
این موضوع در مطالعاتی که اختلاف viability میان گروه ها کوچک است اهمیت بیشتری پیدا می کند، زیرا تغییرات جزئی ناشی از شرایط کشت می توانند نسبت سیگنال به نویز آزمایش را تحت تأثیر قرار دهند.
ملاحظات مربوط به ترنسفکشن و مطالعات مولکولی
در بسیاری از پروتکل های ترنسفکشن، توصیه می شود که در یک بازه زمانی مشخص، شرایط محیطی به شکل کنترل شده تغییر کند و برخی مکمل ها یا عوامل ضدمیکروبی حذف شوند. علت این مسئله آن است که ترکیبات موجود در محیط می توانند بر تعامل کمپلکس های ترنسفکشن با سلول یا وضعیت فیزیولوژیک سلول اثر بگذارند.
بنابراین در مطالعاتی که از Lipofection، Polymer-based Transfection یا روش های مشابه استفاده می شود، باید دستورالعمل کیت یا پروتکل معتبر همان سیستم بررسی شود. نمی توان صرفاً بر اساس اینکه یک ماده در کشت روتین استفاده می شود، نتیجه گرفت که حضور آن در تمام مراحل ترنسفکشن نیز مناسب است.
در مطالعات مولکولی مانند qPCR، RNA extraction و بررسی بیان ژن نیز حفظ ثبات شرایط کشت اهمیت دارد، زیرا تغییر شرایط محیطی ممکن است به تغییرات فیزیولوژیک و در نتیجه تغییر در الگوی بیان ژن منجر شود.
نگهداری و پایداری محلول
شرایط نگهداری محلول های حاوی Amphotericin B باید مطابق دستورالعمل سازنده انجام شود، زیرا پایداری محصول به فرمولاسیون، حلال، غلظت، ظرف نگهداری، دما و میزان مواجهه با نور وابسته است. برخی محصولات به شکل محلول آماده مصرف عرضه می شوند و برخی دیگر ممکن است به صورت پودر یا فرمولاسیون خاص ارائه شوند.
استفاده از aliquotهای مناسب می تواند تعداد دفعات باز و بسته شدن ویال اصلی و در نتیجه احتمال آلودگی یا تغییر شرایط نگهداری را کاهش دهد. همچنین چرخه های مکرر freeze-thaw برای بسیاری از محلول های زیستی مطلوب نیست و بهتر است شرایط نگهداری دقیقاً بر اساس مشخصات محصول رعایت شود.
نباید صرفاً از روی ظاهر محلول درباره فعالیت ضدقارچی آن قضاوت کرد؛ شفاف بودن محلول الزاماً به معنی حفظ کامل فعالیت بیولوژیک نیست و در کاربردهای حساس باید به تاریخ انقضا، شرایط نگهداری و اطلاعات QC محصول توجه شود.
خطاهای رایج هنگام استفاده
یکی از خطاهای رایج، استفاده از غلظت بالاتر با این تصور است که هرچه مقدار ماده ضدقارچ بیشتر باشد، کشت ایمن تر خواهد بود. افزایش غلظت می تواند سمیت سلولی را افزایش دهد و در عین حال مشکل اصلی آلودگی را حل نکند.
خطای دیگر، استفاده از یک حجم ثابت برای محصولات مختلف است. چون غلظت استوک محصولات تجاری می تواند متفاوت باشد، حجم مصرفی باید بر اساس غلظت واقعی محصول و غلظت نهایی مورد نظر محاسبه شود.
همچنین اضافه کردن محلول به محیط در شرایط غیراستریل می تواند خود باعث آلودگی شود. استفاده از تکنیک آسپتیک، رعایت شرایط کار در کابینت مناسب و جلوگیری از تماس غیرضروری درپوش ها و نوک سمپلر با سطوح از اصول پایه ای است که باید همواره رعایت شود.
آیا می توان کشت آلوده را با افزایش غلظت نجات داد؟
اگر در یک کشت سلولی آلودگی قارچی واضح مشاهده شود، افزایش خودسرانه غلظت ماده ضدقارچ معمولاً راهکار مناسبی برای نجات کشت نیست. دلیل این موضوع آن است که هدف از افزودن ماده در کشت استاندارد، عمدتاً پیشگیری یا کاهش احتمال رشد آلودگی است، نه جایگزینی یک فرآیند decontamination.
کشت آلوده می تواند حاوی تعداد زیادی سلول قارچی یا اسپور باشد و حتی اگر رشد ظاهری آن موقتاً مهار شود، احتمال باقی ماندن آلاینده وجود دارد. علاوه بر این، افزایش غلظت می تواند هم زمان به سلول های مورد مطالعه آسیب وارد کند.
در محیط های تحقیقاتی که حفظ صحت نتایج اهمیت دارد، معمولاً کشت مشکوک یا آلوده باید مطابق SOP آزمایشگاه قرنطینه یا حذف شود و منبع آلودگی نیز بررسی گردد؛ برای مثال، محیط، مکمل ها، ظروف، تجهیزات، تکنیک کار و سایر کشت های مجاور باید از نظر احتمال آلودگی ارزیابی شوند.
نقش تکنیک آسپتیک در کنار استفاده از ضدقارچ
هیچ ماده ضدمیکروبی نمی تواند جایگزین تکنیک آسپتیک صحیح شود. استفاده از Amphotericin B تنها یکی از لایه های کنترل خطر آلودگی است و باید در کنار ضدعفونی مناسب سطوح، استفاده صحیح از کابینت ایمنی زیستی، مدیریت مواد مصرفی، کنترل رفت وآمد، رعایت بهداشت دست و استفاده صحیح از تجهیزات انجام شود.
اگر یک آزمایشگاه به شکل مداوم با آلودگی قارچی مواجه است، اولین سؤال نباید این باشد که «چه مقدار بیشتری از ماده ضدقارچ اضافه کنیم؟»، بلکه باید منشأ ورود آلودگی شناسایی شود. بررسی الگوی زمانی آلودگی، محل مشاهده، نوع مورفولوژی و ارتباط میان فلاکس های مختلف می تواند در ریشه یابی بسیار مفید باشد.
در یک سیستم کنترل آلودگی مناسب، استفاده از عوامل ضدمیکروبی آخرین خط دفاع نیست، بلکه تنها بخشی از یک مجموعه اقدامات پیشگیرانه و کنترلی محسوب می شود.
کاربرد در آزمایشگاه های تحقیقاتی و تولید سلولی
در آزمایشگاه های تحقیقاتی، استفاده از عوامل ضدقارچ می تواند برای برخی کشت های روتین یا سیستم هایی که ریسک آلودگی بالاتری دارند مفید باشد، اما میزان و مدت مصرف باید متناسب با هدف مطالعه تعیین شود. در مطالعات حساس، ممکن است محقق ترجیح دهد از محیط بدون آنتی بیوتیک یا ضدقارچ استفاده کند تا اثرات مداخله ای مواد اضافی به حداقل برسد.
در فرایندهای تولید سلولی و سیستم های تحت الزامات GMP، موضوع پیچیده تر است و استفاده از مواد ضدمیکروبی باید با الزامات فرایند، مواد اولیه، کنترل آلودگی، مستندسازی و الزامات محصول نهایی هماهنگ باشد. در چنین محیط هایی نمی توان استفاده از یک ماده ضدقارچ را جایگزین کنترل مهندسی و فرآیندی آلودگی کرد.
در تولید محصولات سلولی، کنترل آلودگی باید بر پایه طراحی مناسب فرایند، کنترل محیط، کیفیت مواد اولیه، پایش تجهیزات و اجرای دقیق SOPها شکل بگیرد.
چه زمانی حذف آن از محیط منطقی است؟
در برخی آزمایش ها حذف عوامل ضدمیکروبی می تواند منطقی باشد، به خصوص زمانی که هدف مطالعه بررسی اثر یک ترکیب بر سلول، مطالعه متابولیسم، ترنسفکشن، مطالعات مولکولی یا تولید داده هایی باشد که حضور عوامل خارجی می تواند بر تفسیر آن ها اثر بگذارد.
همچنین در شرایطی که آزمایشگاه از یک سیستم کنترل آلودگی قوی برخوردار است، ممکن است کشت سلولی بدون استفاده از عوامل ضدمیکروبی انجام شود. مزیت این رویکرد آن است که در صورت ورود آلودگی، رشد آن سریع تر آشکار می شود و احتمال پنهان ماندن یک آلودگی در اثر مهار نسبی کاهش پیدا می کند.
البته حذف آن باید با توجه به نوع سلول، هدف آزمایش، سطح ریسک آلودگی و SOP آزمایشگاه انجام شود. بنابراین «استفاده نکردن» نیز مانند «استفاده کردن» باید یک تصمیم علمی و کنترل شده باشد، نه یک قانون عمومی برای تمام کشت های سلولی.
انتخاب محصول و توجه به مشخصات فنی
هنگام خرید یا انتخاب یک محصول تجاری، تنها نام ماده نباید معیار تصمیم گیری باشد. غلظت استوک، نوع فرمولاسیون، حلال، شرایط نگهداری، تاریخ انقضا، استریلیتی، محدوده کاربرد توصیه شده توسط سازنده و اطلاعات مربوط به QC از جمله مواردی هستند که باید بررسی شوند.
اگر محصول برای کشت سلول طراحی شده باشد، بهتر است مشخصات مربوط به cell culture grade و استریلیتی آن بررسی شود. همچنین باید مشخص باشد که آیا محصول آماده مصرف است یا نیاز به رقیق سازی دارد و آیا سازنده غلظت نهایی مشخصی را برای سیستم های کشت پیشنهاد کرده است.
در آزمایش های حساس و قابل انتشار، ثبت lot number و اطلاعات محصول نیز اهمیت دارد، زیرا تغییر lot می تواند در برخی شرایط باعث تغییرات جزئی در عملکرد سیستم کشت شود و مستندسازی دقیق، تکرارپذیری آزمایش را افزایش می دهد.
اهمیت کنترل کیفیت و پایش مداوم کشت
استفاده از یک عامل ضدقارچ نباید باعث شود پایش روزانه کشت سلولی نادیده گرفته شود. بررسی مورفولوژی سلول ها، رنگ و شفافیت محیط، سرعت رشد، چسبندگی سلول ها و وجود ذرات غیرطبیعی می تواند اطلاعات ارزشمندی درباره وضعیت کشت فراهم کند.
در کنار این بررسی های روتین، کنترل آلودگی باید شامل برنامه مشخصی برای تست های اختصاصی باشد. به ویژه مایکوپلاسما باید به صورت مستقل پایش شود، زیرا عدم مشاهده کدورت یا قارچ و باکتری قابل مشاهده، به معنی سالم بودن کامل کشت نیست.
یک سیستم QC مناسب باید بتواند بین تغییرات واقعی ناشی از تیمار آزمایشی و تغییرات ناشی از شرایط کشت یا آلودگی تمایز ایجاد کند. به همین دلیل، استفاده از عوامل ضدمیکروبی تنها زمانی ارزشمند است که در کنار یک سیستم جامع کنترل کیفیت کشت سلولی قرار گیرد.
