ایمونوبلاتینگ چیست؟ (Immunoblotting / Western Blot)
ایمونوبلاتینگ که بیشتر با نام وسترن بلات (Western Blot) شناخته می شود، یک تکنیک کلاسیک و بسیار مهم در زیست مولکولی و ایمونولوژی است که برای شناسایی، بررسی و اندازه گیری نسبی پروتئین های خاص در یک نمونه بیولوژیک استفاده می شود.
به زبان ساده:
در ایمونوبلاتینگ، ابتدا پروتئین ها را از هم جدا می کنیم، بعد آن ها را روی یک غشاء منتقل می کنیم و در نهایت با استفاده از آنتی بادی اختصاصی مشخص می کنیم که آیا پروتئین مورد نظر ما وجود دارد یا نه و مقدارش تقریباً چقدر است.
این روش به ما می گوید:
آیا یک پروتئین خاص در نمونه هست؟
اندازه مولکولی اش چقدر است؟
بیانش کم شده یا زیاد؟
تعریف علمی ایمونوبلاتینگ
ایمونوبلاتینگ یک روش تحلیلی مبتنی بر آنتی ژن–آنتی بادی است که در آن پروتئین های جداشده به وسیله الکتروفورز ژلی، به یک غشای جامد منتقل شده و سپس با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی، شناسایی و آشکارسازی می شوند. سیگنال نهایی معمولاً به صورت رنگی، شیمی لومینسانس یا فلورسانس ثبت می گردد.
تاریخچه ایمونوبلاتینگ
ریشه ایمونوبلاتینگ به دهه ۱۹۷۰ میلادی بازمی گردد.
در سال 1979، پژوهشگری به نام W. Neal Burnette روش انتقال پروتئین ها از ژل به غشاء و شناسایی آن ها با آنتی بادی را استانداردسازی کرد.
اصطلاح Western Blot در واقع یک نام طنزآمیز علمی است:
Southern Blot → برای DNA
Northern Blot → برای RNA
Western Blot → برای پروتئین
با گسترش تحقیقات مولکولی، ایمونوبلاتینگ به یکی از ستون های اصلی آزمایشگاه های تحقیقاتی و تشخیصی تبدیل شد، به ویژه در:
بیولوژی سلولی
سرطان شناسی
ویروس شناسی
ایمونولوژی
محدوده فعالیت و توان تشخیصی ایمونوبلاتینگ
ایمونوبلاتینگ یک روش:
کیفی (Qualitative)
و نیمه کمی (Semi-Quantitative)
به شمار می رود.
ویژگی های مهم:
شناسایی پروتئین ها در محدوده نانوگرم
توان تفکیک بر اساس وزن مولکولی
تشخیص ایزوفرم های مختلف یک پروتئین
بررسی تغییرات بیان پروتئین در شرایط مختلف
این روش برای پاسخ به سؤال «آیا این پروتئین هست یا نه و حدوداً چقدر است؟» فوق العاده است.
اصل و منطق ایمونوبلاتینگ (به زبان ساده)
ایمونوبلاتینگ بر سه اصل اصلی استوار است:
جداسازی پروتئین ها
انتقال پروتئین ها به غشاء
شناسایی اختصاصی با آنتی بادی
اگر آنتی بادی به پروتئین بچسبد، یعنی آن پروتئین در نمونه وجود دارد.
روش انجام ایمونوبلاتینگ (توضیح علمی مرحله به مرحله)
1. استخراج پروتئین
نمونه (سلول، بافت، سرم یا لیزات) با بافرهای خاص لیز می شود تا:
پروتئین ها آزاد شوند
ساختار آن ها حفظ شود
2. تعیین غلظت پروتئین
با روش هایی مانند:
Bradford
BCA
مقدار پروتئین اندازه گیری می شود تا بارگذاری یکنواخت انجام گیرد.
3. الکتروفورز ژلی (SDS-PAGE)
پروتئین ها:
دناتوره می شوند
بر اساس وزن مولکولی در ژل پلی آکریل آمید جدا می شوند
پروتئین های کوچک تر سریع تر حرکت می کنند.
4. انتقال (Blotting)
پروتئین های جداشده از ژل به یک غشاء منتقل می شوند:
نیتروسلولز
یا PVDF
این مرحله معمولاً با جریان الکتریکی انجام می شود.
5. بلوکه کردن غشاء (Blocking)
برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی:
غشاء با BSA یا شیر خشک انکوبه می شود
این مرحله نقش کلیدی در کاهش نویز دارد.
6. افزودن آنتی بادی اولیه
آنتی بادی اولیه:
به صورت اختصاصی به پروتئین هدف متصل می شود
معمولاً چند ساعت یا یک شب انکوبه می شود
7. شست وشو
غشاء چندین بار شسته می شود تا:
آنتی بادی های غیرمتصل حذف شوند
8. افزودن آنتی بادی ثانویه
آنتی بادی ثانویه:
علیه آنتی بادی اولیه است
معمولاً به آنزیم هایی مثل HRP یا AP متصل است
9. آشکارسازی (Detection)
با افزودن سوبسترا:
واکنش شیمیایی رخ می دهد
سیگنال تولید می شود (نور یا رنگ)
10. ثبت و تحلیل
سیگنال ها با:
دستگاه ژل داک
یا فیلم های مخصوص
ثبت و تحلیل می شوند.
کاربردهای ایمونوبلاتینگ
1. تشخیص بیماری های ویروسی
HIV (تست تأییدی)
HTLV
هپاتیت
2. تحقیقات سرطان
بررسی بیان آنکوژن ها
پروتئین های مسیر آپوپتوز
3. علوم اعصاب
پروتئین های سیناپسی
مارکرهای نورودژنراتیو
4. تحقیقات سلولی و مولکولی
بررسی فسفریلاسیون
آنالیز مسیرهای سیگنالینگ
5. کنترل کیفیت آنتی بادی ها
تأیید اختصاصیت آنتی بادی
نتایج حاصل از ایمونوبلاتینگ
نتیجه نهایی معمولاً به صورت:
باندهای مشخص روی غشاء
تفسیر نتایج:
وجود باند → وجود پروتئین
شدت باند → میزان نسبی بیان
موقعیت باند → وزن مولکولی
نتایج به شدت وابسته به:
کیفیت آنتی بادی
شرایط شست وشو
بارگذاری نمونه
محدودیت ها و نکات مهم
زمان بر بودن
نیاز به مهارت عملی بالا
نیمه کمی بودن
احتمال باندهای غیر اختصاصی
حساسیت به شرایط آزمایش
با این حال، ایمونوبلاتینگ همچنان یکی از قابل اعتمادترین روش های تأیید پروتئین است.
