تکنیک ایمونودیفیوژن شعاعی

ایمونودیفیوژن شعاعی چیست؟ (Radial Immunodiffusion – RID)

ایمونودیفیوژن شعاعی (RID) یک تکنیک کلاسیک آزمایشگاهی ایمونولوژیک و کمی است که برای اندازه گیری مقدار پروتئین ها یا آنتی بادی ها در نمونه های بیولوژیکی به کار می رود.

به زبان ساده:
در RID، نمونه حاوی پروتئین (آنتی ژن) روی ژل حاوی آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرد. پروتئین ها با آنتی بادی واکنش داده و حلقه رسوبی تشکیل می دهند. قطر حلقه متناسب با غلظت پروتئین یا آنتی بادی است و با مقایسه با استانداردها می توان مقدار دقیق آن را تعیین کرد.

این روش برای بررسی غلظت پروتئین های سرم، مایعات بدن و لیزات سلولی کاربرد دارد.

تعریف علمی RID

ایمونودیفیوژن شعاعی یک روش کمی مبتنی بر واکنش آنتی ژن–آنتی بادی است که در آن نمونه ها در حفره های روی ژل آگاروز یا ژل ژلاتینی حاوی آنتی بادی اختصاصی قرار می گیرند.
پروتئین ها به صورت دیفیوژن شعاعی به سمت آنتی بادی حرکت کرده و حلقه رسوبی پایدار ایجاد می کنند. قطر این حلقه با غلظت پروتئین موجود در نمونه نسبت مستقیم دارد.
این تکنیک امکان تعیین کمی پروتئین ها را به روشی ساده و قابل اعتماد فراهم می کند.

تاریخچه ایمونودیفیوژن شعاعی

تکنیک RID در دهه ۱۹۵۰ میلادی توسط Mancini و همکاران معرفی شد.

هدف اصلی: اندازه گیری پروتئین ها و ایمونوگلوبولین ها در سرم و مایعات بدن

RID نسخه تکامل یافته ی ایمونودیفیوژن خطی و دو بعدی بود که امکان اندازه گیری کمی و ساده پروتئین ها را فراهم می کرد.

این روش در دهه های ۱۹۶۰ و ۱۹۷۰ به استاندارد آزمایشگاه های بالینی برای سنجش گلوبولین ها و ایمونوگلوبولین ها تبدیل شد.

RID به عنوان یک روش قابل اعتماد، کم هزینه و بدون نیاز به تجهیزات پیچیده شناخته می شود.

محدوده فعالیت و حساسیت RID

حساسیت:
RID قادر است پروتئین ها و ایمونوگلوبولین ها را در محدوده میکروگرم/میلی لیتر تشخیص دهد.

محدوده کاربرد:

سنجش ایمونوگلوبولین های IgG, IgA, IgM در سرم

اندازه گیری پروتئین های اختصاصی در مایعات بدن (CSF، سرم، ادرار)

بررسی پروتئین های لیزات سلولی و نمونه های آزمایشگاهی

ویژگی عملیاتی:

روش کمی (Quantitative)

ساده، کم هزینه و بدون نیاز به تجهیزات پیچیده

مناسب برای آزمایش های تحقیقاتی و بالینی

اصل و منطق عملکرد RID

ژل آگاروز یا ژل ژلاتینی حاوی آنتی بادی اختصاصی آماده می شود.

نمونه حاوی پروتئین هدف (آنتی ژن) در حفره ای از ژل قرار می گیرد.

پروتئین ها به صورت دیفیوژن شعاعی به اطراف حرکت می کنند.

وقتی غلظت پروتئین با آنتی بادی در ژل برابر شود، حلقه رسوبی تشکیل می شود.

قطر حلقه با غلظت پروتئین موجود در نمونه نسبت مستقیم دارد.

با مقایسه با استانداردهای با غلظت مشخص می توان مقدار پروتئین را به طور کمی تعیین کرد.

روش انجام RID (مرحله به مرحله)
1. آماده سازی ژل

استفاده از آگاروز یا ژل ژلاتینی با درصد مشخص

اضافه کردن آنتی بادی اختصاصی به ژل پیش از انجماد

ریختن ژل در پلیت صاف و ایجاد سطح همگن

2. ایجاد حفره ها (Wells)

حفره های کوچک با قطر مشخص در ژل ایجاد می شوند

هر حفره محل قرارگیری نمونه یا استاندارد است

3. افزودن نمونه

نمونه ها و استانداردها به حفره ها اضافه می شوند

پروتئین ها شروع به دیفیوژن شعاعی در ژل می کنند

4. انکوباسیون

ژل در دمای اتاق یا شرایط مناسب مرطوب انکوبه می شود

مدت زمان: چند ساعت تا شب، بسته به سرعت دیفیوژن پروتئین

5. شکل گیری حلقه رسوبی

حلقه ها وقتی تشکیل می شوند که آنتی ژن به تعادل با آنتی بادی برسد

حلقه ها رنگی یا مات دیده می شوند

6. اندازه گیری حلقه ها

قطر حلقه ها با خط کش یا نرم افزار اندازه گیری می شود

رابطه بین قطر و غلظت پروتئین با استاندارد رسم شده و مقدار نمونه تعیین می شود

7. تحلیل نتایج

استفاده از منحنی استاندارد برای تعیین غلظت دقیق

نمودارها و داده ها به صورت کمی گزارش می شوند

کاربردهای RID
1. تشخیص بالینی

سنجش ایمونوگلوبولین های IgG, IgA, IgM

بررسی پروتئین های سرم و CSF در بیماران

تشخیص کمبود یا افزایش پروتئین های اختصاصی

2. تحقیقات ایمنی شناسی

اندازه گیری پروتئین های سرم و لیزات سلولی

بررسی پاسخ ایمنی به آنتی ژن ها

3. کنترل کیفیت

سنجش پروتئین ها در محصولات دارویی یا واکسن ها

بررسی ثبات و غلظت آنتی بادی ها

4. آزمایشگاه های آموزشی و تحقیقاتی

آموزش تکنیک های ایمونولوژی

سنجش کمی پروتئین های استاندارد

5. کاربردهای تخصصی

تشخیص بیماری های نقص ایمنی

بررسی تغییرات پروتئین های سرم در بیماری های مزمن

نتایج RID

خروجی به شکل حلقه های رسوبی روی ژل

قطر حلقه با غلظت پروتئین نمونه رابطه مستقیم دارد

با مقایسه با استانداردها می توان مقدار دقیق پروتئین را تعیین کرد

داده ها به صورت کمی (Quantitative) گزارش می شوند

محدودیت ها و نکات مهم

زمان بر بودن (چند ساعت تا شب برای دیفیوژن)

حساسیت به دمای محیط و درصد ژل

محدود به پروتئین ها یا آنتی ژن هایی که واکنش اختصاصی با آنتی بادی دارند

مناسب برای پروتئین های تک و کمی

نمی تواند اطلاعاتی در مورد وزن مولکولی پروتئین بدهد

نیاز به استانداردهای دقیق برای دقت بالا

با این حال، RID به دلیل سادگی، کم هزینه بودن و قابلیت سنجش کمی پروتئین ها، هنوز در بسیاری از آزمایشگاه ها کاربرد دارد.