تکنیک ایمونوسیتوشیمی

تکنیک ایمونوسیتوشیمی چیست؟

ایمونوسیتوشیمی (Immunocytochemistry – ICC) یک تکنیک آزمایشگاهی بسیار مهم در علوم زیستی، پزشکی و تحقیقات سلولی است که به شناسایی و مشاهده ی پروتئین ها یا آنتی ژن های خاص در سطح یا داخل سلول های منفرد می پردازد. ICC شباهت زیادی به ایمونوهیستوشیمی (IHC) دارد، اما تفاوت اصلی آن در این است که به جای بافت ها، روی سلول های معلق یا کشت شده انجام می شود. به زبان ساده، ICC به دانشمندان و پزشکان امکان می دهد تا با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی، پروتئین های خاص را در سلول ها شناسایی کرده و محل، میزان و الگوی بیان آن ها را مشاهده کنند.

تعریف ساده تکنیک ایمونوسیتوشیمی
ایمونوسیتوشیمی روشی آزمایشگاهی است که با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی، پروتئین ها یا آنتی ژن های خاص را در سلول ها شناسایی و با رنگ های قابل مشاهده یا فلورسانس آشکار می کند.

توضیح به زبان ساده تکنیک ایمونوسیتوشیمی
در بدن ما، سلول ها پروتئین ها و مولکول های متنوعی تولید می کنند که مسئول عملکرد طبیعی یا بیماری های مختلف هستند. فرض کنید می خواهیم بدانیم یک پروتئین خاص در کدام سلول ها وجود دارد و چه مقدار تولید شده است. در ICC، سلول ها به صورت منفرد روی لام یا در کشت سلولی آماده می شوند. سپس آنتی بادی اختصاصی علیه پروتئین هدف به آن ها اضافه می شود. آنتی بادی ها یا به صورت مستقیم نشاندار شده با رنگ یا فلورسانس هستند یا از آنتی بادی ثانویه نشاندار برای آشکارسازی استفاده می شود. بعد از شستشو و آماده سازی، نمونه ها زیر میکروسکوپ بررسی می شوند. مناطقی که پروتئین هدف وجود دارد به صورت رنگی یا فلورسانس دیده می شوند و امکان تحلیل کمی و کیفی پروتئین در سلول ها فراهم می گردد.

تاریخچه ایمونوسیتوشیمی
پایه های ICC از همان اصول اولیه ایمونوفلورسانس و ایمونوهیستوشیمی گرفته شده است. در دهه ی 1940، آلبرت کونز و همکارانش برای اولین بار آنتی بادی ها را با فلوروکروم نشاندار کرده و آن ها را روی بافت ها مشاهده کردند. این روش بعدها توسعه یافت و دانشمندان متوجه شدند می توان از همین اصول برای سلول های منفرد نیز استفاده کرد.

در دهه 1960 و 1970، تکنیک های نشاندار کردن آنتی بادی با آنزیم ها مانند پراکسیداز و فلوروکروم ها تکمیل شد و ICC به ابزار مهمی برای بررسی سلول ها در تحقیقات علمی و تشخیص بالینی تبدیل شد. امروزه ICC در مطالعات سلولی، تحقیقات سرطان، شناسایی مسیرهای سیگنالینگ، داروسازی و تشخیص بیماری ها کاربرد گسترده دارد.

مبنای علمی روش
ICC بر سه اصل اساسی بنا شده است:

اتصال اختصاصی آنتی بادی به آنتی ژن
آنتی بادی ها مولکول هایی هستند که به شکل اختصاصی به پروتئین یا آنتی ژن مورد نظر متصل می شوند. این اتصال باعث می شود پروتئین هدف به طور ویژه شناسایی شود.

نشاندار کردن آنتی بادی ها
آنتی بادی ها با آنزیم هایی مانند HRP یا با فلوروکروم های پایدار مانند FITC نشاندار می شوند تا اتصال قابل مشاهده باشد.

مشاهده و تحلیل
با استفاده از میکروسکوپ نوری یا فلورسنت، محل، الگو و شدت بیان پروتئین هدف در سلول ها بررسی می شود.

روش انجام (شرح علمی مرحله به مرحله)

آماده سازی سلول ها
سلول ها می توانند از کشت سلولی، نمونه های خونی یا سلول های موجود در مایع های بدن (مانند مایع نخاعی) تهیه شوند. سلول ها روی لام شیشه ای یا چاهک های کشت سلولی قرار می گیرند و با فیکساسیون مناسب (مثلاً متانول، استون یا پارافورمالدئید) تثبیت می شوند تا ساختار سلولی حفظ شود و پروتئین هدف دسترسی پذیر باقی بماند.

مسدودسازی (Blocking)
برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی ها، نمونه ها با محلول های مسدودکننده مانند BSA یا سرم غیرایمن پوشانده می شوند.

افزودن آنتی بادی اولیه
آنتی بادی اختصاصی علیه پروتئین هدف به سلول ها اضافه می شود و برای مدت مشخص در دمای مناسب انکوبه می گردد تا اتصال کامل صورت گیرد.

شستشو
لام ها با بافر مناسب (مانند PBS) شسته می شوند تا آنتی بادی های غیرمتصل حذف شوند.

افزودن آنتی بادی ثانویه نشاندار
اگر آنتی بادی اولیه نشاندار نشده باشد، آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم یا فلوروکروم اضافه می شود. این آنتی بادی ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل شده و سیگنال قابل مشاهده تولید می کند.

افزودن سوبسترا (در روش آنزیمی)
در صورتی که آنتی بادی ثانویه آنزیمی باشد، سوبسترا مانند DAB یا NBT-BCIP اضافه می شود تا رنگ قابل مشاهده تولید گردد.

مشاهده با میکروسکوپ
نمونه ها با میکروسکوپ نوری یا فلورسنت بررسی می شوند. رنگ یا فلورسانس در سلول ها نشان دهنده حضور و میزان پروتئین هدف است. همچنین الگوی توزیع پروتئین (هسته ای، سیتوپلاسمی، غشایی) تحلیل می شود.

کاربردهای ایمونوسیتوشیمی

تحقیقات سلولی و مولکولی
ICC برای بررسی بیان پروتئین ها، مسیرهای سیگنالینگ و تعامل بین مولکول ها در سلول ها استفاده می شود. این اطلاعات برای درک عملکرد سلول و مکانیسم بیماری ها اهمیت دارد.

تشخیص سرطان ها
با ICC می توان سلول های سرطانی را شناسایی و پروفایل مولکولی آن ها را مشخص کرد، به ویژه در سرطان های خونی یا سلول های منفرد متاستاتیک.

تشخیص عفونت ها
ICC می تواند حضور عوامل عفونی مانند ویروس ها یا باکتری ها را در سلول ها مشخص کند.

شناسایی پروتئین های سلولی
برای تشخیص توزیع پروتئین ها در هسته، سیتوپلاسم یا غشاء سلولی استفاده می شود.

بررسی پاسخ دارویی
در مطالعات دارویی، ICC برای ارزیابی اثر دارو روی بیان پروتئین های خاص یا تغییرات سلولی به کار می رود.

نتایج و تفسیر
نتایج ICC بر اساس چند پارامتر بررسی می شوند:

مثبت یا منفی بودن
وجود رنگ یا فلورسانس در سلول ها نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است.

شدت و درصد سلول های مثبت
تعداد سلول هایی که پروتئین هدف را بیان می کنند و شدت رنگ یا فلورسانس، میزان بیان پروتئین را نشان می دهد.

الگوی بیان
پروتئین ها ممکن است هسته ای، سیتوپلاسمی یا غشایی باشند که این اطلاعات برای تشخیص و تحلیل عملکرد سلولی اهمیت دارد.

مقایسه با کنترل ها
کنترل مثبت و منفی برای اطمینان از صحت آزمایش استفاده می شود.

محدوده فعالیت این روش
ICC در آزمایشگاه های تحقیقاتی، سلولی، مولکولی و تشخیصی انجام می شود. تجهیزات مورد نیاز شامل:

میکروسکوپ نوری یا فلورسنت

انکوباتور و سیستم های شستشو

آنتی بادی های اولیه و ثانویه نشاندار

مواد فیکساسیون و سوبسترا

لام ها و محیط های کشت سلولی

مزایا

حساسیت و اختصاصیت بالا

امکان مشاهده مستقیم پروتئین ها در سلول ها

کاربرد گسترده در تحقیقات سلولی، سرطان و داروسازی

امکان تحلیل الگوی بیان و توزیع پروتئین

محدودیت ها

وابسته به کیفیت آنتی بادی ها

نیاز به کنترل های دقیق و استاندارد

احتمال رنگ آمیزی غیر اختصاصی

نیاز به مهارت پرسنل و تجهیزات پیشرفته