تکنیک ایمونوفلورسانس غیرمستقیم

تکنیک ایمونوفلورسانس غیرمستقیم چیست؟

ایمونوفلورسانس غیرمستقیم (Indirect Immunofluorescence – IIF) یکی از روش های مهم و پرکاربرد در آزمایشگاه های ایمونولوژی و پاتولوژی است که برای شناسایی آنتی بادی ها یا آنتی ژن های خاص در سرم خون یا سایر نمونه های زیستی استفاده می شود. این تکنیک بر پایه ی همان اصل کلاسیک واکنش اختصاصی آنتی ژن–آنتی بادی طراحی شده است، اما برخلاف روش مستقیم، از یک آنتی بادی ثانویه نشاندار شده با ماده فلورسنت برای آشکارسازی استفاده می کند؛ به همین دلیل به آن «غیرمستقیم» گفته می شود.

تعریف ساده تکنیک ایمونوفلورسانس غیرمستقیم
ایمونوفلورسانس غیرمستقیم روشی آزمایشگاهی است که در آن ابتدا آنتی بادی موجود در نمونه بیمار به آنتی ژن مشخص متصل می شود و سپس با استفاده از یک آنتی بادی دوم که دارای رنگ فلورسنت است، این اتصال قابل مشاهده می گردد.

توضیح به زبان ساده تکنیک ایمونوفلورسانس غیرمستقیم
اگر بخواهیم خیلی ساده توضیح بدهیم، در این روش دانشمندان می خواهند ببینند آیا در خون یک فرد، آنتی بادی خاصی وجود دارد یا نه. برای این کار، آنتی ژن مورد نظر را روی یک لام شیشه ای قرار می دهند. سپس سرم خون بیمار را روی آن می ریزند. اگر در خون فرد آنتی بادی علیه آن آنتی ژن وجود داشته باشد، به آن می چسبد. اما چون این آنتی بادی قابل دیدن نیست، یک آنتی بادی دوم که به رنگ فلورسنت متصل است اضافه می شود. این آنتی بادی دوم به آنتی بادی اول می چسبد و وقتی نمونه زیر میکروسکوپ فلورسنت قرار می گیرد، محل اتصال به صورت نور درخشان دیده می شود. بنابراین درخشش یعنی وجود آنتی بادی مورد نظر در بدن فرد.

تاریخچه ایمونوفلورسانس غیرمستقیم
پایه های روش ایمونوفلورسانس در دهه 1940 میلادی شکل گرفت. در سال 1941، آلبرت کونز (Albert Coons) موفق شد آنتی بادی ها را با مواد فلورسنت نشاندار کند و واکنش های ایمنی را در بافت ها مشاهده نماید. این دستاورد علمی مسیر جدیدی در ایمونولوژی تشخیصی باز کرد.

مدتی بعد مشخص شد که می توان از یک سیستم دو مرحله ای برای افزایش حساسیت استفاده کرد؛ یعنی ابتدا آنتی بادی اولیه بدون رنگ به آنتی ژن متصل شود و سپس یک آنتی بادی ثانویه فلورسنت که علیه آنتی بادی اولیه ساخته شده است، برای آشکارسازی به کار رود. این ایده باعث تولد روش ایمونوفلورسانس غیرمستقیم شد.

در دهه های 1950 و 1960، این روش برای تشخیص بیماری های خودایمنی مانند لوپوس و بررسی آنتی بادی های ضد هسته (ANA) گسترش یافت. با پیشرفت تولید فلوروکروم هایی مانند FITC (Fluorescein Isothiocyanate) و بهبود میکروسکوپ های فلورسنت، دقت و کارایی IIF افزایش پیدا کرد. امروزه این روش یکی از استانداردهای طلایی در غربالگری بیماری های خودایمنی محسوب می شود.

مبنای علمی روش
IIF بر سه اصل اساسی استوار است:

اختصاصیت واکنش آنتی ژن–آنتی بادی

اتصال آنتی بادی ثانویه نشاندار به آنتی بادی اولیه

آشکارسازی فلورسانس با میکروسکوپ فلورسنت

در این روش، آنتی بادی اولیه که در سرم بیمار وجود دارد، به آنتی ژن هدف متصل می شود. سپس آنتی بادی ثانویه که علیه ایمونوگلوبولین انسانی ساخته شده و به فلوروکروم متصل است (مثلاً Anti-human IgG-FITC)، به آنتی بادی اولیه می چسبد. این اتصال چندگانه باعث تقویت سیگنال فلورسانس و افزایش حساسیت آزمایش می شود.

روش انجام (شرح علمی مرحله به مرحله)

آماده سازی بستر آنتی ژن
ابتدا آنتی ژن مناسب روی لام قرار داده می شود. این آنتی ژن می تواند سلول های کشت داده شده (مانند HEp-2 برای ANA)، مقاطع بافتی حیوانی (مانند کلیه موش یا معده موش) یا ذرات خاص باشد.

افزودن سرم بیمار
سرم خون بیمار که حاوی آنتی بادی های احتمالی است، به صورت رقیق شده روی لام اضافه می شود. نمونه برای مدت مشخص (معمولاً 30 دقیقه) در دمای اتاق یا 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شود.

شستشو
لام با بافر مناسب مانند PBS شسته می شود تا آنتی بادی های غیرمتصل حذف شوند.

افزودن آنتی بادی ثانویه فلورسنت
آنتی بادی ثانویه که علیه IgG یا IgM انسانی ساخته شده و با فلوروکروم (معمولاً FITC) نشاندار شده است، روی لام اضافه می شود.

انکوباسیون مجدد
نمونه مجدداً برای مدت مشخص انکوبه می شود تا اتصال کامل صورت گیرد.

شستشوی نهایی
شستشوی دقیق برای حذف آنتی بادی های اضافی انجام می شود.

مشاهده با میکروسکوپ فلورسنت
لام زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی می شود. نوع الگوی فلورسانس، شدت آن و محل درخشش ثبت می گردد.

کاربردهای ایمونوفلورسانس غیرمستقیم

تشخیص بیماری های خودایمنی
مهم ترین کاربرد IIF در شناسایی آنتی بادی های خودایمنی است، مانند:

آنتی بادی ضد هسته (ANA) در لوپوس

آنتی بادی ضد سیتوپلاسم نوتروفیل (ANCA) در واسکولیت ها

آنتی بادی ضد میتوکندری (AMA) در سیروز صفراوی اولیه

آنتی بادی ضد عضله صاف (ASMA)

تشخیص عفونت ها
در برخی بیماری های ویروسی و انگلی، از IIF برای شناسایی آنتی بادی علیه عامل عفونی استفاده می شود.

بررسی تیتر آنتی بادی
با رقیق سازی متوالی سرم می توان تیتر آنتی بادی را تعیین کرد. بالاترین رقتی که هنوز فلورسانس مشاهده شود، تیتر گزارش می شود.

تحقیقات علمی
در پژوهش های سلولی و مولکولی برای بررسی بیان پروتئین ها در سلول ها استفاده می شود.

نتایج و تفسیر
نتایج IIF بر اساس چند پارامتر تفسیر می شود:

مثبت یا منفی بودن
وجود فلورسانس مشخص نشان دهنده مثبت بودن آزمایش است.

الگوی فلورسانس
در تست ANA الگوهای مختلفی دیده می شود، مانند:

هموژن (Homogeneous)

اسپکلد (Speckled)

نوکلئولار (Nucleolar)

سنترومری (Centromere)

هر الگو می تواند با بیماری خاصی ارتباط داشته باشد.

شدت فلورسانس
به صورت ضعیف، متوسط یا قوی گزارش می شود.

تیتر
مثلاً 1:40، 1:160، 1:640 که نشان دهنده میزان آنتی بادی در خون است.

محدوده فعالیت این روش
IIF در آزمایشگاه های تخصصی ایمونولوژی، روماتولوژی، پاتولوژی و مراکز تحقیقاتی انجام می شود. تجهیزات مورد نیاز شامل:

میکروسکوپ فلورسنت

انکوباتور

لام های آماده آنتی ژن

آنتی بادی های ثانویه نشاندار

سیستم شستشو و کنترل کیفی

این روش نیازمند پرسنل آموزش دیده برای تفسیر صحیح الگوهای فلورسانس است، زیرا خواندن نتایج تا حدی وابسته به تجربه است.

مزایا

حساسیت بالا

امکان تقویت سیگنال

قابلیت تعیین تیتر

کاربرد گسترده در بیماری های خودایمنی

محدودیت ها

احتمال نتایج مثبت کاذب

وابستگی به مهارت فرد تفسیرکننده

زمان بر بودن نسبت به برخی روش های اتوماتیک مانند ELISA

نیاز به تجهیزات پیشرفته

تفاوت اصلی با ایمونوفلورسانس مستقیم
در روش مستقیم، آنتی بادی نشاندار مستقیماً به آنتی ژن بافتی متصل می شود. اما در روش غیرمستقیم، از یک آنتی بادی ثانویه نشاندار برای آشکارسازی استفاده می شود که باعث افزایش حساسیت و امکان اندازه گیری تیتر می شود.