Phosphate Buffered Saline چیست؟
Phosphate Buffered Saline که معمولاً با مخفف PBS شناخته می شود، یکی از رایج ترین محلول های بافری مورد استفاده در آزمایشگاه های زیست شناسی سلولی و مولکولی است. این محلول از یک سیستم بافری فسفات به همراه نمک های معدنی تشکیل شده و به گونه ای طراحی می شود که pH و اسمولاریته آن برای بسیاری از کاربردهای سلولی در محدوده قابل قبولی قرار داشته باشد. وجود یون های فسفات در کنار یون های سدیم و کلراید باعث ایجاد محیطی با ظرفیت بافری مشخص و فشار اسمزی نسبتاً سازگار با سلول های پستانداران می شود.
در کشت سلول، PBS معمولاً برای شست وشوی سلول ها، حذف بقایای محیط کشت، آماده سازی سطح سلول پیش از تریپسینایز کردن، رقیق سازی برخی مواد و انجام مراحل مختلف آزمایشگاهی استفاده می شود. با وجود کاربرد گسترده، PBS یک محیط کشت سلولی محسوب نمی شود، زیرا فاقد مجموعه مواد غذایی، اسیدهای آمینه، ویتامین ها، منابع انرژی و سایر اجزای مورد نیاز برای رشد و تکثیر سلول است.
یکی از ویژگی های مهم این محلول، ایجاد تعادل نسبی میان شرایط یونی و اسمزی محیط خارج سلولی است؛ به همین دلیل در بسیاری از مراحل کار با سلول ها می توان از آن برای تماس های کوتاه مدت استفاده کرد، بدون اینکه مانند آب خالص باعث شوک اسمزی شدید به سلول شود.
ساختار شیمیایی و اجزای تشکیل دهنده
ترکیب PBS می تواند بسته به فرمولاسیون مورد استفاده، کاربرد آزمایشگاهی و شرکت سازنده اندکی متفاوت باشد، اما فرمول های متداول آن معمولاً شامل سدیم کلراید، پتاسیم کلراید، نمک های فسفات سدیم و پتاسیم و آب با کیفیت مناسب هستند. مهم ترین نقش این ترکیبات، تنظیم قدرت یونی، اسمولاریته و سیستم بافری محلول است.
سدیم کلراید بخش مهمی از شرایط یونی محلول را ایجاد می کند و یون های سدیم و کلراید در تنظیم فشار اسمزی نقش دارند. مقدار نسبتاً کمتری از پتاسیم کلراید نیز می تواند در فرمولاسیون های استاندارد وجود داشته باشد. بخش بافری توسط زوج های اسید و باز فسفات ایجاد می شود که عمدتاً از گونه های H₂PO₄⁻ و HPO₄²⁻ تشکیل شده اند.
این سیستم بافری در محدوده نزدیک به pH فیزیولوژیک عملکرد مناسبی دارد، اما ظرفیت آن نامحدود نیست. بنابراین اگر مقدار زیادی ماده اسیدی یا بازی به محلول اضافه شود، PBS نمی تواند بدون تغییر قابل توجه pH را حفظ کند.
نقش سیستم فسفات در کنترل pH
یکی از دلایل اصلی استفاده از این محلول در آزمایشگاه های سلولی، وجود سیستم بافری فسفات است. یک بافر از یک اسید ضعیف و باز مزدوج آن تشکیل می شود و می تواند در برابر تغییرات pH ناشی از اضافه شدن مقادیر محدود اسید یا باز مقاومت ایجاد کند.
در سیستم فسفات، تعادل میان گونه های مختلف فسفات وابسته به pH است. رابطه میان نسبت فرم بازی و اسیدی را می توان با معادله هندرسون–هاسلبالچ توصیف کرد:
pH = pKa + log([A⁻]/[HA])
بنابراین تغییر نسبت گونه های فسفاتی می تواند pH نهایی محلول را تغییر دهد. در PBS با pH نزدیک به 7.2 تا 7.4، نسبت مناسب میان گونه های فسفات باعث می شود محلول بتواند در برابر تغییرات محدود pH مقاومت کند.
البته در کشت سلول، سیستم کنترل pH تنها به PBS یا فسفات محدود نیست. محیط های کشت سلولی معمولاً دارای سیستم های دیگری مانند بیکربنات/CO₂ هستند که در شرایط انکوباسیون نقش بسیار مهمی در حفظ pH دارند.
اسمولاریته و اهمیت آن برای سلول ها
سلول های پستانداران نسبت به تغییرات فشار اسمزی محیط اطراف خود حساس هستند. اگر محیط بیش از حد هیپرتونیک باشد، آب از سلول خارج شده و سلول دچار انقباض می شود. در مقابل، یک محیط هیپوتونیک می تواند باعث ورود بیش از حد آب به سلول، تورم و در شرایط شدید، آسیب غشایی و لیز سلولی شود.
فرمولاسیون PBS به گونه ای طراحی شده است که در حالت استاندارد، اسمولاریته آن برای بسیاری از کاربردهای کوتاه مدت سلولی قابل قبول باشد. با این حال، اسمولاریته دقیق به فرمولاسیون، غلظت نمک ها و نحوه تهیه محلول وابسته است.
این نکته به خصوص هنگام تهیه PBS از پودر یا محلول های کنسانتره اهمیت دارد. اشتباه در محاسبه رقت یا تبخیر آب می تواند غلظت نمک ها را تغییر دهد و در نتیجه بر شرایط اسمزی اثر بگذارد.
کاربرد در شست وشوی سلول های چسبنده
یکی از شناخته شده ترین کاربردهای PBS در کشت سلول، شست وشوی سلول های چسبنده است. در طول کشت، محیط حاوی مواد مغذی، متابولیت ها، پروتئین های ترشح شده، بقایای سلولی و سایر اجزا است. در برخی مراحل آزمایش لازم است این مواد از سطح سلول حذف شوند.
برای مثال، پیش از استفاده از تریپسین، معمولاً محیط کشت حاوی سرم از روی سلول حذف شده و سطح سلول با یک محلول مناسب شست وشو داده می شود. علت اهمیت این مرحله آن است که پروتئین های موجود در سرم می توانند فعالیت تریپسین را مهار کنند.
شست وشو باید با ملایمت انجام شود، زیرا سلول های چسبنده به ویژه در برخی لاین ها ممکن است در اثر جریان شدید مایع یا تماس مکانیکی نامناسب از سطح جدا شوند. حجم مورد استفاده نیز باید متناسب با ظرف کشت و پروتکل آزمایش انتخاب شود.
نقش آن در مرحله تریپسینایز کردن
در بسیاری از پروتکل های پاساژ سلولی، PBS پیش از افزودن Trypsin-EDTA مورد استفاده قرار می گیرد. هدف اصلی، حذف باقی مانده محیط کشت از سطح سلول و فراهم کردن شرایط مناسب تر برای عملکرد آنزیم است.
وجود کلسیم و منیزیم می تواند در چسبندگی سلول به سطح و همچنین برخی فرآیندهای وابسته به اتصال سلولی نقش داشته باشد. به همین دلیل بسیاری از فرمولاسیون های مورد استفاده برای شست وشوی سلول ها به صورت Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS تهیه می شوند.
در نتیجه، هنگام انتخاب یک محصول آماده یا تهیه محلول از پودر، باید مشخص شود که آیا کلسیم و منیزیم در فرمولاسیون وجود دارند یا خیر. این ویژگی برای همه کاربردها یکسان نیست و انتخاب باید بر اساس پروتکل آزمایش انجام شود.
تفاوت PBS دارای کلسیم و منیزیم با نوع فاقد آن ها
یکی از نکات مهم در کار با PBS، تفاوت میان فرمولاسیون های حاوی یون های دوظرفیتی و فرمولاسیون های فاقد آن ها است. کلسیم و منیزیم در بسیاری از تعاملات سلولی، از جمله برخی مکانیسم های چسبندگی سلول، نقش دارند و حضور آن ها می تواند رفتار سلول را در فرآیند شست وشو یا جداسازی تغییر دهد.
برای شست وشوی معمول سلول پیش از تریپسینایز کردن، اغلب از فرمولاسیونی استفاده می شود که فاقد Ca²⁺ و Mg²⁺ باشد تا شرایط مناسب تری برای جداسازی سلول ایجاد شود. با این حال، در برخی کاربردهای دیگر، حضور این یون ها می تواند مطلوب باشد.
بنابراین عبارت «PBS» به تنهایی همیشه اطلاعات کافی درباره ترکیب دقیق محلول ارائه نمی دهد. هنگام سفارش یا تهیه محلول باید مشخصات کامل فرمولاسیون، از جمله pH، غلظت، وجود یا عدم وجود Ca/Mg و استریلیتی بررسی شود.
کاربرد در شست وشوی سلول های معلق
اگرچه شست وشو با PBS بیشتر در مورد سلول های چسبنده مطرح می شود، در برخی پروتکل ها برای سلول های سوسپانسیونی نیز کاربرد دارد. در این شرایط، سلول ها معمولاً از محیط جدا شده و با سانتریفیوژ در شرایط مناسب جمع آوری می شوند.
پس از تشکیل pellet، می توان در برخی پروتکل ها سلول ها را با محلول مناسب شست وشو داد تا ترکیبات محیط، پروتئین ها، مواد درمانی یا سایر عوامل محلول از اطراف سلول حذف شوند. سپس سلول ها مجدداً در محیط مورد نظر سوسپانسه می شوند.
در این مرحله باید به مدت تماس سلول با PBS توجه شود. این محلول فاقد مواد غذایی لازم برای رشد سلول است و بنابراین برای نگهداری طولانی مدت سلول ها طراحی نشده است.
کاربرد در آزمایش های سلولی و مولکولی
PBS فقط محدود به پاساژ سلولی نیست و در بسیاری از پروتکل های آزمایشگاهی کاربرد دارد. در برخی روش های immunostaining، immunofluorescence، ELISA، Western blot و روش های مرتبط با زیست شناسی سلولی، از محلول های فسفاتی برای شست وشو یا تهیه برخی محلول ها استفاده می شود.
با این حال، انتخاب PBS یا یک بافر دیگر باید بر اساس ماهیت آزمایش انجام شود. در برخی روش های پروتئینی، فسفات ممکن است با برخی واکنش های شیمیایی یا اجزای خاص سیستم آزمایش تداخل داشته باشد. برای مثال، در بعضی کاربردهای وابسته به آنزیم ها، حضور یون های فسفات یا نمک های خاص ممکن است بر عملکرد سیستم اثر بگذارد.
به همین دلیل استفاده از PBS نباید صرفاً بر اساس رایج بودن آن انجام شود و باید سازگاری با روش مورد نظر بررسی شود.
تفاوت PBS با محیط کشت سلولی
یکی از اشتباهات رایج در آموزش کشت سلول، یکسان در نظر گرفتن PBS و محیط کشت است. PBS یک محلول نمکی بافرشده است و وظیفه اصلی آن فراهم کردن یک محیط یونی و بافری موقت است، در حالی که محیط کشت برای تأمین نیازهای متابولیکی سلول طراحی شده است.
محیط هایی مانند DMEM، RPMI 1640، MEM و DMEM/F12 دارای آمینواسیدها، ویتامین ها، نمک ها، منابع انرژی و سایر ترکیبات مورد نیاز برای رشد سلول هستند. بسته به نوع محیط، ممکن است سرم، گلوتامین، فاکتورهای رشد یا مکمل های دیگر نیز به آن اضافه شوند.
در مقابل، PBS فاقد بسیاری از این مواد است. بنابراین قرار دادن سلول ها در آن برای مدت طولانی می تواند باعث ایجاد استرس و کاهش viability شود. استفاده صحیح از آن معمولاً به مراحل کوتاه و مشخص پروتکل محدود می شود.
نحوه تهیه محلول از پودر یا کنسانتره
PBS را می توان به صورت محلول آماده، پودر یا محلول غلیظ خریداری کرد. در صورت استفاده از پودر، باید مقدار مشخص شده توسط تولیدکننده در حجم مناسب آب با کیفیت آزمایشگاهی حل شود. کیفیت آب مورد استفاده اهمیت زیادی دارد، زیرا یون ها و ناخالصی های موجود در آب می توانند ترکیب نهایی محلول را تغییر دهند.
اگر محلول به صورت 10X تهیه شده باشد، برای تهیه محلول 1X باید یک قسمت محلول 10X با نه قسمت حلال مناسب مخلوط شود. برای مثال، برای تهیه حجم نهایی مشخصی از محلول 1X، می توان از رابطه عمومی C1V1=C2V2 استفاده کرد.
پس از تهیه، pH باید در صورت نیاز کنترل شود و محلول از نظر شفافیت، رسوب، تغییر رنگ یا سایر نشانه های غیرطبیعی بررسی شود. در کاربردهای حساس سلولی، استفاده از محلول استریل و کنترل شده اهمیت ویژه ای دارد.
استریل سازی و اهمیت شرایط آسپتیک
PBS مورد استفاده در کشت سلولی باید از نظر آلودگی میکروبی کنترل شده باشد. یکی از روش های متداول برای استریل کردن محلول های سازگار با حرارت، اتوکلاو کردن است؛ اما مناسب بودن اتوکلاو برای هر فرمولاسیون باید بر اساس دستورالعمل سازنده و پایداری اجزای آن تعیین شود.
در بسیاری از آزمایشگاه ها، محلول های آماده و استریل PBS به دلیل سهولت مصرف و کاهش ریسک خطای آماده سازی مورد استفاده قرار می گیرند. هنگام انتقال محلول به ظروف دیگر نیز باید اصول آسپتیک رعایت شود تا محلول استریل مجدداً آلوده نشود.
استفاده از PBS آلوده می تواند یکی از مسیرهای ورود میکروارگانیسم ها به کشت سلولی باشد. از این رو، ظاهر شفاف محلول به تنهایی اثبات کننده استریلیتی آن نیست و در سیستم های حساس باید منبع و وضعیت کنترل کیفی محلول مشخص باشد.
کنترل pH در محلول آماده شده
pH یکی از پارامترهای مهم در PBS است و مقدار آن باید با فرمولاسیون و کاربرد مورد نظر سازگار باشد. بسیاری از فرمولاسیون های رایج برای کاربردهای سلولی در محدوده نزدیک به pH فیزیولوژیک تهیه می شوند، اما عدد دقیق باید از مشخصات محصول یا دستور تهیه همان فرمولاسیون استخراج شود.
استفاده از pH متر کالیبره برای بررسی دقیق pH مناسب تر از تکیه بر رنگ محلول است. همچنین باید توجه داشت که pH برخی بافرها می تواند تحت تأثیر دما قرار گیرد؛ بنابراین مقایسه نتایج باید با در نظر گرفتن شرایط اندازه گیری انجام شود.
تنظیم pH با اسید یا باز باید پیش از استریل سازی و مطابق دستورالعمل تهیه محلول انجام شود. اضافه کردن مقدار زیاد اسید یا باز پس از تهیه می تواند علاوه بر تغییر pH، ترکیب یونی و ظرفیت بافری را نیز تحت تأثیر قرار دهد.
نقش دما در عملکرد و نگهداری
دما می تواند بر ویژگی های شیمیایی بافرها، pH و پایداری برخی اجزای محلول اثر بگذارد. بنابراین شرایط نگهداری باید بر اساس اطلاعات تولیدکننده یا SOP آزمایشگاه تعیین شود.
در زمان استفاده از محلول، رساندن آن به دمای مناسب پروتکل نیز می تواند اهمیت داشته باشد. در برخی فرآیندهای سلولی، تماس ناگهانی سلول با محلول بسیار سرد می تواند یک استرس فیزیولوژیک ایجاد کند، به خصوص زمانی که سلول ها حساس باشند.
همچنین در صورت مشاهده رسوب یا تغییر ظاهری غیرعادی، استفاده از محلول باید متوقف شده و علت بررسی شود. تغییرات فیزیکی می توانند ناشی از آلودگی، خطای تهیه، تبخیر، تغییر pH یا شرایط نامناسب نگهداری باشند.
تأثیر بر مورفولوژی و زنده مانی سلول
در شرایط استاندارد و تماس کوتاه مدت، بسیاری از لاین های سلولی PBS را به خوبی تحمل می کنند. با این حال، تحمل سلول به این محلول مطلق نیست و عواملی مانند نوع سلول، مدت تماس، دما، اسمولاریته و وجود یا عدم وجود یون های دوظرفیتی می توانند بر پاسخ سلول اثر بگذارند.
اگر تماس بیش از حد طولانی شود، سلول دیگر مواد مغذی محیط کشت را دریافت نمی کند و شرایط یونی نیز ممکن است برای فعالیت طبیعی سلولی ایده آل نباشد. در نتیجه، کاهش viability یا تغییر مورفولوژی ممکن است مشاهده شود.
سلول های اولیه و برخی سلول های حساس ممکن است نسبت به تغییرات محیطی واکنش شدیدتری داشته باشند. بنابراین زمان و شرایط استفاده باید با توجه به نوع سلول و دستورالعمل آزمایش تعیین شود.
خطاهای رایج هنگام استفاده
یکی از خطاهای رایج، استفاده طولانی مدت از PBS به عنوان جایگزین محیط کشت است. این محلول برای تغذیه سلول طراحی نشده و نمی تواند نیازهای متابولیکی سلول را تأمین کند.
خطای دیگر استفاده از فرمولاسیون نامناسب برای مرحله مورد نظر است. برای مثال، اگر پروتکل به محلول فاقد Ca/Mg نیاز داشته باشد، استفاده از فرمولاسیون حاوی این یون ها می تواند نتیجه مرحله شست وشو یا جداسازی را تغییر دهد.
همچنین رقیق سازی نادرست محلول های 10X، استفاده از آب نامناسب، عدم کنترل pH، نگهداری در شرایط نامناسب، استفاده پس از آلودگی یا انقضا و ایجاد آلودگی هنگام کار آسپتیک از خطاهایی هستند که می توانند کیفیت آزمایش را کاهش دهند.
تفاوت PBS با HBSS و سایر محلول های شست وشو
PBS تنها محلول بافرشده مورد استفاده در کشت سلولی نیست. HBSS یا Hank's Balanced Salt Solution نیز یکی از محلول های رایج در زیست شناسی سلولی است، اما ترکیب یونی و سیستم بافری آن با PBS یکسان نیست.
PBS عمدتاً بر پایه سیستم فسفات طراحی شده است، در حالی که HBSS می تواند ترکیبی از نمک ها و اجزای دیگر داشته باشد و برخی فرمولاسیون های آن حاوی گلوکز، کلسیم، منیزیم یا سیستم های بافری متفاوت هستند.
بنابراین نمی توان همیشه این محلول ها را بدون بررسی پروتکل جایگزین یکدیگر کرد. انتخاب میان آن ها باید بر اساس نوع سلول، مدت تماس، کاربرد آزمایش، وجود یا عدم وجود یون های دوظرفیتی و الزامات روش انجام شود.
کنترل کیفی و انتخاب محصول مناسب
برای کاربردهای کشت سلول، کیفیت PBS اهمیت زیادی دارد، زیرا این محلول ممکن است مستقیماً با سلول تماس داشته باشد. هنگام انتخاب محصول آماده، مواردی مانند استریلیتی، pH، اسمولاریته، فرمولاسیون نمکی، وجود یا عدم وجود Ca/Mg، کیفیت آب، تاریخ انقضا و شرایط نگهداری باید بررسی شود.
در آزمایشگاه هایی که کنترل کیفیت ساختاریافته دارند، ثبت شماره بچ، تاریخ دریافت و تاریخ باز شدن محلول می تواند به ردیابی مشکلات احتمالی کمک کند. در صورت مشاهده آلودگی یا تغییر غیرعادی در چند کشت مختلف، بررسی محلول های مشترک از جمله PBS نیز اهمیت پیدا می کند.
همچنین برای آزمایش های حساس، بهتر است از محصولاتی استفاده شود که مشخصات فنی و گواهی کیفیت آن ها توسط تولیدکننده ارائه شده باشد. انتخاب محصول صرفاً بر اساس قیمت یا نام تجاری بدون توجه به فرمولاسیون می تواند باعث ناسازگاری با پروتکل شود.
کاربرد در آزمایشگاه های تحقیقاتی و تشخیصی
PBS در طیف گسترده ای از فعالیت های آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می گیرد. در کشت سلولی، شست وشوی سلول، پاساژ، آماده سازی نمونه و برخی فرآیندهای جداسازی از کاربردهای اصلی آن هستند. در زیست شناسی مولکولی و پروتئینی نیز می توان از آن برای شست وشو، رقیق سازی یا تهیه برخی محلول ها استفاده کرد.
در روش های ایمونولوژیک، انتخاب بافر مناسب اهمیت ویژه ای دارد، زیرا ترکیب یونی و pH می تواند بر اتصال آنتی ژن و آنتی بادی، فعالیت پروتئین ها و background آزمایش اثر بگذارد. بنابراین حتی در کاربردهایی که PBS یک انتخاب متداول است، باید دستورالعمل روش اصلی رعایت شود.
در سیستم های آموزشی نیز شناخت دقیق تفاوت PBS با محیط کشت، محلول های نمکی متعادل و بافرهای تخصصی به دانشجویان کمک می کند تا کاربرد هر محلول را بر اساس منطق شیمیایی و فیزیولوژیک آن درک کنند، نه صرفاً بر اساس یک دستورالعمل حفظ شده.