دات بلات چیست؟ (Dot Blot Assay)
دات بلات (Dot Blot) یک تکنیک آزمایشگاهی ایمونولوژیک ساده، سریع و حساس است که برای تشخیص و شناسایی وجود یک پروتئین، آنتی ژن، یا نوکلئیک اسید خاص در نمونه های بیولوژیکی استفاده می شود.
به زبان ساده:
در دات بلات، نمونه ها به شکل یک نقطه کوچک (Dot) روی غشاء ثابت می شوند و سپس با آنتی بادی یا پروب اختصاصی بررسی می شوند. این روش برخلاف وسترن بلات نیاز به جداسازی پروتئین ها با الکتروفورز ندارد و سرعت انجام آن بالاست.
می توان آن را نسخه سریع و اولیه ی وسترن بلات دانست که برای بررسی تعداد زیادی نمونه در زمان کوتاه ایده آل است.
تعریف علمی دات بلات
دات بلات یک روش ایمونواسی یا هایبریداسیون است که در آن، نمونه ی حاوی پروتئین یا نوکلئیک اسید روی فاز جامد (غشاء نیتروسلولز یا PVDF) اعمال می شود و سپس با آنتی بادی یا پروب اختصاصی شناسایی می گردد. شدت سیگنال حاصل (رنگ، شیمی لومینسانس یا فلورسانس) با مقدار ماده ی هدف نسبت مستقیم دارد.
تاریخچه دات بلات
تکنیک دات بلات در دهه ۱۹۸۰ میلادی به عنوان یک نسخه ساده و سریع وسترن بلات معرفی شد.
هدف اصلی:
سرعت دادن به تشخیص پروتئین ها
کاهش نیاز به تجهیزات پیچیده الکتروفورز
امکان پردازش تعداد زیاد نمونه همزمان
این روش ابتدا در تحقیقات بیوشیمی و ویروس شناسی برای بررسی بیان آنتی ژن ها و تأیید نتایج اولیه مورد استفاده قرار گرفت.
محدوده فعالیت و حساسیت دات بلات
دات بلات ویژگی های مهمی دارد:
حساسیت:
قابلیت شناسایی پروتئین ها در حد نانوگرم تا میکروگرم
دامنه کاربرد:
پروتئین ها
پپتیدها
نوکلئیک اسیدها
مارکرهای ویروسی و باکتریایی
ویژگی عملیاتی:
سریع و آسان
مناسب نمونه های زیاد
نیمه کمی (Semi-Quantitative)
با این حال، دات بلات اطلاعاتی در مورد وزن مولکولی پروتئین نمی دهد و نمی تواند ایزوفرم ها را تفکیک کند، بر خلاف وسترن بلات.
اصل و منطق عملکرد دات بلات
سه عنصر اصلی دات بلات مشابه ایمونوبلاتینگ هستند:
نمونه حاوی پروتئین یا آنتی ژن
غشاء جامد برای تثبیت نمونه
آنتی بادی یا پروب اختصاصی برای شناسایی
منطق کار:
نمونه روی غشاء اعمال می شود، سپس آنتی بادی یا پروب به آن متصل می شود و با آنزیم یا سوبسترا، سیگنال تولید می شود. شدت سیگنال، بیانگر میزان ماده ی هدف است.
روش انجام دات بلات (مرحله به مرحله)
1. آماده سازی غشاء
استفاده از PVDF یا نیتروسلولز
غشاء قبل از استفاده ممکن است با متانول فعال شود (برای PVDF)
غشاء روی پلیت یا صفحه ای صاف قرار می گیرد
2. آماده سازی نمونه
نمونه ها شامل پروتئین یا نوکلئیک اسید
رقیق سازی مناسب برای جلوگیری از سیگنال غیرخطی
3. اعمال نمونه (Spotting)
چند میکرولیتر از نمونه با پیپت روی غشاء ریخته می شود
تشکیل یک نقطه (Dot) که بعداً تثبیت می شود
4. تثبیت نمونه روی غشاء
نمونه ممکن است با حرارت یا UV ثابت شود
یا در دمای اتاق و با خشک شدن غشاء
5. بلوکه کردن (Blocking)
جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی
مواد رایج: BSA، شیر خشک، ژلاتین
6. افزودن آنتی بادی اولیه
آنتی بادی اختصاصی پروتئین یا نوکلئیک اسید مورد نظر اضافه می شود
مدت زمان انکوباسیون: معمولاً 1 تا 2 ساعت یا شب
7. شست وشو
حذف آنتی بادی های غیر متصل با محلول شست وشو
8. افزودن آنتی بادی ثانویه
آنتی بادی متصل به آنزیم (HRP یا AP)
متصل شدن به آنتی بادی اولیه و ایجاد امکان آشکارسازی
9. آشکارسازی
افزودن سوبسترا (مثلاً TMB یا NBT/BCIP)
ظهور نقطه رنگی یا نورانی متناسب با مقدار ماده ی هدف
10. ثبت نتایج
مشاهده با چشم یا دستگاه های تصویربرداری
شدت رنگ قابل مقایسه با استانداردها برای تعیین میزان ماده
کاربردهای دات بلات
1. تحقیقات ویروس شناسی
شناسایی آنتی ژن های ویروسی
تشخیص سریع حضور ویروس در نمونه ها
2. بررسی بیان پروتئین ها
نمونه های سلولی و بافتی
تأیید نتایج اولیه الایزا یا وسترن بلات
3. تشخیص مارکرهای بیماری
آنتی بادی ها و پروتئین های مرتبط با بیماری ها
4. غربالگری سریع
پردازش تعداد زیادی نمونه در زمان کوتاه
مثال: تست های اولیه دارویی یا تحقیقاتی
5. تحقیقات پایه
بررسی بیان پروتئین در مسیرهای بیوشیمیایی
آنالیز واکنش های ایمونولوژیک
نتایج دات بلات
خروجی به شکل نقاط رنگی یا نورانی روی غشاء
وجود نقطه → وجود پروتئین یا آنتی ژن
شدت نقطه → میزان تقریبی ماده
مقایسه با استانداردها → نیمه کمی بودن داده ها
محدودیت ها و نکات مهم
عدم ارائه اطلاعات وزن مولکولی
نیمه کمی بودن نتایج (Semi-Quantitative)
حساسیت به حجم و غلظت نمونه
مناسب نبودن برای تفکیک ایزوفرم ها یا پروتئین های مشابه
نیاز به آنتی بادی های اختصاصی
با این حال، به دلیل سرعت و سادگی بالا، همچنان ابزار ارزشمندی برای:
غربالگری اولیه
بررسی سریع پروتئین ها
آزمایش های تحقیقاتی مقدماتی
است.