طراحی پرایمر برای RPA چیست
طراحی پرایمر برای RPA یک تکنیک نوین در زیست شناسی مولکولی است که امکان تکثیر سریع DNA یا RNA را در دمای ثابت (۲۵–۴۲°C) فراهم می کند. در این روش، ریکامبینازها به پرایمرها متصل می شوند و آن ها را به نواحی مکمل در توالی هدف هدایت می کنند، سپس با کمک پلیمراز مقاوم به جریان ریزش، تکثیر ایزوترمال انجام می شود.
پرایمرهای RPA معمولاً ۳۰–۳۵ نوکلئوتید طول دارند تا اتصال پایدار و اختصاصی به توالی هدف داشته باشند و از تولید محصول غیر اختصاصی جلوگیری شود. این روش نسبت به PCR سنتی سریع تر است و در کمتر از ۲۰–۳۰ دقیقه سیگنال قابل تشخیص تولید می کند.
به زبان ساده، پرایمرهای RPA مانند کلیدهایی هستند که به ریکامبیناز وصل می شوند و توالی هدف را شناسایی می کنند؛ واکنش تک دما باعث می شود این فرآیند بدون دستگاه PCR پیچیده و در شرایط میدانی قابل انجام باشد.
تعریف علمی طراحی پرایمر برای RPA
از منظر علمی، طراحی پرایمر برای RPA شامل مراحل زیر است:
انتخاب ناحیه هدف اختصاصی: طول ۱۰۰–۲۰۰ جفت باز برای اطمینان از اتصال و تکثیر پایدار.
طراحی پرایمر اختصاصی: طول ۳۰–۳۵ نوکلئوتید، درصد GC ۴۰–۶۰٪، Tm حدود ۵۵–۶۵°C.
بررسی ساختارهای ثانویه: جلوگیری از Hairpin، Self-dimer و Cross-dimer برای افزایش اختصاصیت.
تنظیم غلظت پرایمرها و شرایط ایزوترمال: اطمینان از بازده بالا و تولید محصول مشخص.
اعتبارسنجی اختصاصیت: استفاده از BLAST و نرم افزارهای طراحی پرایمر برای اطمینان از شناسایی فقط توالی هدف.
محاسبه Tm پرایمرها با فرمول Nearest-Neighbor انجام می شود:
Tm = ΔH / (ΔS + R × ln[C/4]) – 273.15 + 16.6 × log[Na+]
که ΔH و ΔS انرژی های آنتالپی و آنتروپی اتصال، C غلظت پرایمر و [Na+] غلظت یون سدیم محیط واکنش است. درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ تنظیم می شود تا اتصال اختصاصی و پایدار ایجاد شود.
تاریخچه طراحی پرایمر برای RPA
روش RPA برای اولین بار در اوایل دهه ۲۰۰۰ معرفی شد و به سرعت به عنوان یک روش تکثیر سریع و تک دما با اختصاصیت بالا شناخته شد. ایده اصلی استفاده از ریکامبیناز برای هدایت پرایمرها به نواحی مکمل و پلیمراز مقاوم به جریان ریزش بود تا نیاز به چرخه های حرارتی PCR حذف شود.
RPA به سرعت در تشخیص ویروس ها و باکتری ها، شناسایی جهش ها و واریانت های نادر و اندازه گیری ژن های هدف در محیط های میدانی و آزمایشگاهی به کار گرفته شد.
محدوده فعالیت طراحی پرایمر برای RPA
پرایمرهای RPA در حوزه های زیر کاربرد دارند:
تشخیص سریع ویروس ها و باکتری ها حتی در نمونه های با تعداد کم DNA/RNA.
تشخیص میدانی و کم تجهیزات به دلیل ایزوترمال بودن واکنش.
شناسایی جهش ها و SNPهای نادر با اختصاصیت بالا.
اندازه گیری تقریبی ژن ها و تعیین کپی عدد ژن در نمونه های بالینی و تحقیقاتی.
کنترل کیفیت و تشخیص آلاینده ها در صنایع غذایی، دارویی و محیط زیست.
روش انجام طراحی پرایمر برای RPA به صورت علمی
1. انتخاب ناحیه هدف
انتخاب یک توالی اختصاصی ۱۰۰–۲۰۰ جفت باز برای تضمین اتصال و تکثیر پایدار.
2. طراحی پرایمرها
طول پرایمر: ۳۰–۳۵ نوکلئوتید
Tm پرایمر: ۵۵–۶۵°C
درصد GC: ۴۰–۶۰٪
3. بررسی ساختار ثانویه و اختصاصیت
حذف Hairpin، Self-dimer و Cross-dimer
بررسی اختصاصیت با BLAST و Primer-BLAST
4. اجرای واکنش
واکنش ایزوترمال در ۳۷–۴۲°C
استفاده از ریکامبیناز و پلیمراز مقاوم به جریان ریزش
مشاهده محصول با فلورسانس یا رنگ های متابولیک
5. اعتبارسنجی تجربی
اندازه گیری زمان تا سیگنال مثبت (Time to Positivity)
اطمینان از تولید محصول تک اختصاصی با الکتروفورز یا منحنی فلورسانس
مثال های کاربردی واقعی
تشخیص SARS-CoV-2 با RPA: پرایمرهای اختصاصی RPA برای ژن N طراحی شدند و واکنش کمتر از ۲۰ دقیقه سیگنال مثبت ایجاد کرد.
تشخیص Influenza A و B: پرایمرهای RPA با آمپلیکون ۱۵۰–۱۸۰ جفت باز توانستند ویروس ها را با دقت بالا شناسایی کنند.
شناسایی MRSA در محیط میدانی: پرایمرهای RPA برای ژن mecA طراحی شدند و امکان تشخیص سریع فراهم شد.
نتایج و مزایای استفاده از طراحی پرایمر برای RPA
سرعت بالا و زمان کوتاه واکنش (۱۵–۳۰ دقیقه)
اختصاصیت مناسب به دلیل طول بلند پرایمر و هدایت ریکامبیناز
امکان انجام واکنش در دمای ثابت بدون نیاز به دستگاه PCR
قابلیت تشخیص توالی های کم وفراوان حتی در نمونه های محدود
کاربرد گسترده در تشخیص ویروس ها، باکتری ها و شناسایی جهش ها
محدودیت ها و چالش ها
طراحی پرایمر نسبت به PCR سنتی پیچیده تر است
احتمال تولید محصولات غیر اختصاصی در صورت طراحی نامناسب
نیاز به بهینه سازی دقیق دما و غلظت یون ها
عدم امکان اندازه گیری دقیق کمیت DNA/RNA بدون فلورسانس و استاندارد