طراحی پرایمر برای ریل تایم پی سی آر مولکولار بیکن

طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR چیست

طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR یک تکنیک پیشرفته در زیست شناسی مولکولی است که امکان تشخیص کمّی و اختصاصی DNA یا RNA را با استفاده از پروب های Molecular Beacon فراهم می کند. پروب های Molecular Beacon به شکل Hairpin هستند و در غیاب توالی هدف فلوروفور و کوئنچر به هم متصلند و سیگنال فلورسانس تولید نمی کنند. هنگامی که پروب به توالی هدف متصل می شود، ساختار Hairpin باز شده و فلورسانس آزاد می شود، که این باعث می شود واکنش PCR همزمان، اختصاصی و با پس زمینه بسیار پایین انجام شود.

پرایمرهای Molecular Beacon معمولاً برای تولید آمپلیکون کوتاه (۵۰–۱۵۰ جفت باز) طراحی می شوند تا بازده PCR بالا باشد و پروب بتواند به طور مؤثر به توالی هدف متصل شود.

به زبان ساده، طراحی پرایمر Molecular Beacon مانند کلید و حسگر اختصاصی است؛ پرایمرها تکثیر را آغاز می کنند و پروب Molecular Beacon تنها در حضور توالی هدف فلورسانس ایجاد می کند، بنابراین تشخیص حتی واریانت های نادر بسیار دقیق است.

تعریف علمی طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR

از منظر علمی، طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR شامل مراحل زیر است:

انتخاب ناحیه هدف کوتاه و اختصاصی (۵۰–۱۵۰ جفت باز) برای تولید آمپلیکون پایدار و مناسب اتصال پروب.

طراحی پرایمر ۱۸–۲۵ نوکلئوتیدی با درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ و Tm مناسب.

طراحی پروب Molecular Beacon ۲۰–۳۰ نوکلئوتیدی با Tm حدود ۵–۱۰°C بالاتر از پرایمرها.

طراحی ساختار Hairpin پروب با انرژی آزاد منفی برای جلوگیری از فلورسانس در غیاب توالی هدف.

بررسی و حذف ساختارهای ثانویه پرایمر و پروب (Self-dimer، Cross-dimer).

اعتبارسنجی اختصاصیت پرایمر و پروب با پایگاه های داده ژنومی و نرم افزارهای BLAST و Primer-BLAST.

محاسبه Tm برای پرایمر و پروب معمولاً با فرمول Nearest-Neighbor انجام می شود:

Tm = ΔH / (ΔS + R × ln[C/4]) – 273.15 + 16.6 × log[Na+]

که ΔH و ΔS انرژی های آنتالپی و آنتروپی اتصال، C غلظت پرایمر و [Na+] غلظت یون سدیم محیط PCR است. درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ برای ایجاد اتصال اختصاصی و پایدار انتخاب می شود.

تاریخچه طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR

پروب های Molecular Beacon در اواسط دهه ۱۹۹۰ معرفی شدند و با هدف افزایش اختصاصیت و کاهش پس زمینه نسبت به TaqMan و SYBR Green طراحی شدند. ایده اصلی استفاده از ساختار Hairpin بود تا فلورسانس تنها در حضور توالی هدف ایجاد شود و تشخیص جهش ها یا SNPهای نادر امکان پذیر گردد.

از سال ۲۰۰۰ به بعد، Molecular Beacon qPCR در تشخیص ویروس ها مانند HIV، Influenza، و SARS-CoV-2، اندازه گیری دقیق بیان ژن و تعیین کپی عدد ژن در ژنتیک انسانی و حیوانی به کار گرفته شد.

محدوده فعالیت طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR

پرایمرهای Molecular Beacon qPCR در حوزه های زیر کاربرد دارند:

تشخیص اختصاصی ویروس ها و باکتری ها حتی در نمونه هایی با تعداد کم DNA/RNA.

اندازه گیری دقیق بیان ژن ها در سلول ها یا نمونه های محدود.

شناسایی واریانت های نادر و جهش های تک نوکلئوتیدی (SNP).

تعیین کپی عدد ژن و تحلیل SNPها در ژنتیک انسانی و حیوانی.

مطالعات اپیدمیولوژی و تحقیقاتی برای ردیابی ویروس ها و باکتری ها و بررسی مسیر انتشار بیماری ها.

روش انجام طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR به صورت علمی
1. انتخاب ناحیه هدف

انتخاب آمپلیکون کوتاه (۵۰–۱۵۰ جفت باز) برای بازده بالای PCR و امکان اتصال مؤثر پروب Molecular Beacon.

2. طراحی پرایمر و پروب

طول پرایمر: ۱۸–۲۵ نوکلئوتید

طول پروب Molecular Beacon: ۲۰–۳۰ نوکلئوتید

Tm پروب حدود ۵–۱۰°C بالاتر از پرایمرها

طراحی Hairpin پروب برای ایجاد خاموشی فلورسانس در غیاب توالی هدف

3. محاسبه Tm و درصد GC

Tm پرایمرها ±۲°C نزدیک هم

درصد GC بین ۴۰–۶۰٪

نرم افزارهای Primer3 و OligoAnalyzer برای محاسبه دقیق Tm و انرژی آزاد و بررسی ساختار ثانویه استفاده می شوند

4. بررسی اختصاصیت و ساختار ثانویه

جلوگیری از Hairpin، Self-dimer و Cross-dimer در پرایمر و پروب

بررسی اختصاصیت با BLAST و Primer-BLAST

5. اعتبارسنجی تجربی

اجرای qPCR و رسم نمودار Ct

بررسی Fluorescence Signal و منحنی Melt برای اطمینان از تولید محصول تک اختصاصی

مثال های کاربردی واقعی

تشخیص SARS-CoV-2 و Influenza: پروب Molecular Beacon با آمپلیکون ۹۰–۱۲۰ جفت باز طراحی شد و اختصاصیت بالایی حتی در نمونه های با RNA کمتر از ۱۰ مولکول ایجاد شد.

شناسایی SNPهای نادر HIV: پروب Molecular Beacon امکان تشخیص جهش هایی با فراوانی کمتر از ۱٪ را فراهم کرد.

اندازه گیری بیان ژن های محدود: پروب Molecular Beacon برای ژن GAPDH در سلول های بنیادی استفاده شد و میزان دقیق mRNA اندازه گیری شد.

نتایج و مزایای استفاده از طراحی پرایمر برای Molecular Beacon qPCR

اختصاصیت بسیار بالا نسبت به SYBR Green و TaqMan

کاهش پس زمینه و تولید سیگنال غیر اختصاصی

توانایی تشخیص جهش ها و SNPهای نادر

بازده یکنواخت و قابلیت تکرارپذیری بالا

کاربرد گسترده در تشخیص ویروس، اندازه گیری بیان ژن و تعیین کپی عدد ژن

محدودیت ها و چالش ها

هزینه بالاتر تهیه پروب Molecular Beacon نسبت به SYBR Green

طراحی دقیق پرایمر و پروب نیازمند نرم افزار تخصصی و زمان بر

اختلاف کوچک در Tm یا درصد GC می تواند بازده واکنش را کاهش دهد

نمونه های با کیفیت پایین DNA/RNA ممکن است نتایج غیر دقیق ایجاد کنند