ترکیب شیمیایی و فرمول بندی محیط
محیط L-15 شامل تمامی اسیدهای آمینه ضروری و غیرضروری، الکترولیت ها و ویتامین های مورد نیاز سلول است. به عنوان مثال این محیط حاوی مقدار 900 میلی گرم در لیتر گالاکتوز و 550 میلی گرم در لیتر پیروات سدیم است. از نمک های معدنی می توان به کلرید کلسیم (185.45 mg/L)، کلرید منیزیم و سولفات منیزیم (به ترتیب 200 و 97.67 mg/L)، کلرید پتاسیم (400 mg/L)، فسفات پتاسیم تک (60 mg/L) و نمک های فسفات سدیم (190 mg/L) اشاره کرد. تمام ۲۰ اسید آمینه رایج (مانند آلانین، گلایسین، متیونین، هیستیدین و غیره) و ویتامین های متنوعی (مانند کولین کلرید، اسید فولیک، نیاسین آمید، پیریدوکسین و تیامین) نیز در این فرمول گنجانده شده اند. به طور خلاصه، محیط Leibovitz L-15 یک محیط پایه قوی است که از گلوکز استفاده نمی کند و گالاکتوز را جایگزین آن نموده تا متابولیسم اسیدی کاهش یابد.
روش تهیه و آماده سازی محیط
محیط L-15 به صورت پودری یا مایع آماده عرضه می شود. برای تهیه محلول ۱X از پودر، معمولاً حدود 14.773 گرم پودر در هر لیتر آب تزریقی استریل حل می شود. مراحل کار به شرح زیر است: ابتدا 90٪ حجم نهایی آب ۱۵–۳۰°C را در بشر استریل ریخته و با ملایمت هم می زنیم. سپس پودر محیط را به آهستگی در آن افزوده و کاملاً حل می کنیم. بسته حاوی پودر را با مقدار کمی آب شستشو داده و به مخلوط اضافه می کنیم تا کل ذرات محیط منتقل شود. پس از حل شدن کامل، pH محیط در نقطه دلخواه (معمولاً حوالی 7.4) با استفاده از HCl یا NaOH یک مولار تنظیم می شود. در نهایت حجم به ۱۰۰٪ رسیده و محیط با فیلتر 0.22 میکرون استریل می شود. چنانچه پودر یا محیط حاضره کلوخه باشد یا کدر شود، از استفاده از آن خودداری می کنند.
اجزای بافری و کنترل pH
محیط L-15 برخلاف بسیاری از محیط های رایج، بی کربنات سدیم ندارد و pH آن به کمک فسفات ها، گالاکتوز و اسیدهای آمینه تنظیم می شود. در واقع با حذف گلوکز و جایگزینی آن با گالاکتوز، تولید اسیدهای متابولیکی کاهش یافته و pH در محدوده ۷٫۳ تا ۷٫۹ ثابت نگه داشته می شود. محیط های دارای بی کربنات معمولاً در شرايط ۵ تا ۱۰٪ CO₂ پایداری pH دارند؛ ولی L-15 برای کشت در فضای بدون CO₂ بهینه شده است. در صورت نیاز به بافرینگ اضافی می توان واریانت های حاوی HEPES محیط L-15 را استفاده کرد (HEPES فاقد بی کربنات). به طور کلی، محدوده pH برای محیط خالص L-15 حدود 7.4–7.6 است (pH محلول آماده حدود 7.7±0.3 در دمای اتاق).
اجزای متابولیک: گالاکتوز و پیروات
در L-15 برخلاف محیط های استاندارد کشت سلول که حاوی گلوکز هستند، گالاکتوز ۰٫۹ گرم در لیتر افزوده شده و هیچ گلوکزی وجود ندارد. وجود گالاکتوز به جای گلوکز باعث کاهش تولید اسیدهای فرعی حین متابولیسم سلولی شده و به حفظ pH کمک می کند. مقدار پیروات سدیم نیز در L-15 نسبتاً بالاست (۵۵۰ میلی گرم در لیتر) تا سوخت بیشتری به مسیر کربس ارائه دهد و pH را پایدار نگه دارد. بنابراین L-15 هم زمان از گالاکتوز و پیروات استفاده می کند تا انرژی سلولی را تأمین کند و به تنظیم pH کمک نماید.
افزودنی ها و مکمل ها
محیط Leibovitz L-15 به خودی خود فاقد پروتئین، لیپید و فاکتور رشد است. بنابراین برای رشد مطلوب سلول معمولاً آن را با سرم گاوی جنین (FBS) تکمیل می کنند؛ معمولاً ۱۰٪ FBS به محیط افزوده می شود. علاوه بر سرم، افزودنی های معمول شامل گلوتامین (دو میلی مولار به طور رایج)، آنتی بیوتیک (مانند پنی سیلین-استرپتومایسین)، و روغن معدنی یا عوامل ضد کف در صورت نیاز است. واریانت استاندارد L-15 حاوی L-گلوتمین (300 mg/L) و فنل رد است؛ برخی نسخه ها بدون گلوتامین یا بدون فنل رد عرضه می شوند. اگرچه محیط در دمای اتاق پایداری دارد، معمولاً هنگام افزودن مکمل ها محیط را نزدیک به دمای کشت (۳۷°C) نگه می دارند تا تنش دمایی ایجاد نشود.
نیازهای گازی
محیط L-15 برای کاربرد در شرایط بدون CO₂ طراحی شده است. به عبارت دیگر با حذف بی کربنات سدیم، این محیط pH خود را در تعادل با هوا (حدود 0.04% CO₂) حفظ می کند و نیازی به کشت در انکوباتور CO₂ نیست. در عوض، دما و فشار اتمسفر نرمال (20–21% اکسیژن) برای کشت مناسب اند. برخی کاربردها برای کنترل دقیق تر pH ممکن است محیط با افزودن HEPES را در انکوباتور CO₂ استاندارد استفاده کنند، اما حالت معمول L-15 در شرایط بدون CO₂ کاربرد دارد. بنابراین برخلاف DMEM یا RPMI که نیاز به انکوباتور ۵٪ CO₂ دارند، L-15 به طور ویژه در آزمایش های کشت در شرایط محیطی یا سیستم های باز (مانند فلاسک در هوای آزاد) کاربرد دارد.
دمای کشت و شرایط نگهداری
محیط L-15 باید در دمای یخچال (+2 تا +8 درجه سانتی گراد) نگهداری شود و از نور مستقیم محافظت گردد. به طور کلی، هر گونه تغییر دمایی ناگهانی باید به حداقل برسد. محیط استریل اماده شده را نیز در همین بازه دمایی نگه می دارند و قبل از مصرف به دمای اتاق یا دمای کشت سلول (معمولاً 37°C) می رسانند. زمان نگهداری معمولاً چند هفته تا چند ماه (مثلاً 1 تا 3 ماه) با وجود سرم و آنتی بیوتیک است، ولی بهتر است محیط کشت تازه تهیه شده یا باقیمانده پس از چند هفته دور ریخته شود. پودر خشک در شرایط توصیه شده تا ۳ سال پایدار است.
استریل بودن و کنترل آلودگی
تمام اجزای پودر محیط به طور پلیمیزر (فیلتر استریل) تهیه می شوند و پس از تولید در محیط ایزوله تحت شرایط aseptic بسته بندی می گردند. پس از آماده سازی نیز محیط باید حتماً از طریق فیلتراسیون 0.22 میکرون استریل شود (مرحله 6 در دستورالعمل آماده سازی). به هر حال هر دسته محیط پس از تولید آزمون های کشاورزی (فاقد باکتری، قارچ و مایکوپلاسما) و تعیین اندوتوکسین را نیز می گذراند. به عنوان مثال، گزارش شرکت ATCC نشان داده است که لیبوویتس L-15 با گلوتامین حاوی حداکثر 0.5 EU/mL اندوتوکسین و 305–337 mOsm/Kg اسمولاریته است (بدون آلودگی قارچی یا باکتریایی). بنابراین کیفیت محیط به صورت کامل تضمین می شود و هر گونه کشت سلولی با استفاده از آن باید از شرایط استریل اتاق کشت برخوردار باشد.
تنظیم pH و اسمولاریته محیط
pH طبیعی محیط L-15 آماده شده حدود 7.4–7.6 است؛ در هنگام تهیه معمولاً روی ~7.7 تنظیم می شود. با توجه به مکانیزم بافری متفاوت، اندکی بالاتر رفتن pH (تا حدود 7.8) نیز در فیلترکردن رخ می دهد که پس از آن با همسان سازی دما و هوا تصحیح می گردد. اسمولاریته محیط آماده L-15 در حدود ۳۲۰ میلی اُسمول بر کیلوگرم است (معمولاً بین ۳۰۰ تا ۳۴۰ mOsm/Kg). این مقدار تقریباً معادل محیط های استاندارد است و تغییرات اندک نیز بخاطر افزودن مکمل ها یا درجه محلول سازی آب رخ می دهد. تنظیم دقیق pH و اسمولاریته پس از تهیه با استفاده از بافرهای استاندارد و دستگاه اسمومتر توصیه می شود تا شرایط همواره در محدوده فیزیولوژیک حفظ شود.
انواع سلول های کشت شده
محیط L-15 برای رشد طیف گسترده ای از سلول های پستانداران مناسب است. اغلب سلول های اپی تلیال و کشت های سلولی اولیه در آن کشت می یابند. به عنوان مثال، خطوط سلولی HEP-2 (سلول کلیه میمون)، L929 (فیبروبلاست موش)، MRC-5 (فیبروبلاست ریه جنین انسان) و LLC-MK2 (سلول کلیه میمون) در این محیط رشد خوبی دارند. همچنین از L-15 برای کشت بافت ها و اگزپلنت های اولیه جنینی یا بالغ انسانی استفاده می شود. تحقیقات نشان داده اند که ویروس های متعددی نیز روی این محیط قابلیت تکثیر دارند. از طرف دیگر، محیط های رایج نظیر DMEM بیشتر برای سلول های چسبنده مشتق شده از جانداران مختلف (فیبروبلاست ها، نورون ها، سلول های بنیادی، سلول های سرطانی خطی مانند HeLa یا PC-12) به کار می روند. RPMI-1640 برعکس در کشت سلول های معلق مثل لنفوسیت ها (مونونوکلئر خون محیطی، خط های تومور خون)، ویروس ها و خطوط سرطانی انعقادی (MCF-7، Jurkat و غیره) کاربرد دارد. MEM به طور سنتی برای کشت سلول های تیپیکال چسبنده با سرم ۱۰٪ استفاده می شود. به طور کل، انتخاب محیط کشت بر اساس نیاز سلول و توصیه منابع معتبر صورت می گیرد، ولی L-15 به خصوص برای شرایط بی CO₂ و سلول ها/بافت های اولیه مناسب است.
کاربردها در بیولوژی و پزشکی
Leibovitz L-15 در پژوهش ها و کاربردهای متنوعی استفاده می شود. از آن برای کشت سلول های اولیه (مانند کشت تکه های بافت جنینی و بالغ) و خطوط سلولی رانش مستقیم (مثل کشت سلول های کلیوی میمون) استفاده می شود. این محیط در کشت ویروس ها (برای ویروس هایی که در سلول های پستانداران تکثیر می یابند) و مطالعات تشخیص باکتری ها (آزمایشات پنل سلولی) کاربرد دارد. از آنجا که نیاز CO₂ ندارد، در آزمایش های میکروسکوپی زنده یا انتقال سلول به صورت ex vivo بسیار مناسب است. همچنین در مواردی که کنترل دقیق اسید و باز مهم است (مثلاً کشت سلول های حساس به نوسانات pH)، محیط L-15 می تواند جایگزین مناسبی باشد. در مقابل، برای کشت سلول های متداول آزمایشگاهی که در انکوباتور CO₂ قرار می گیرند، محیط هایی مانند DMEM یا RPMI همچنان پر استفاده اند. به همین دلیل، L-15 اغلب به عنوان یک محیط مکمل برای شرایط خاص در مراکز تحقیقاتی و پزشکی مطرح است.
مزایا و محدودیت ها
مزیت اصلی L-15 عدم نیاز به CO₂ و پایداری خودبه خودی pH آن است. این ویژگی کار با سیستم های کشت باز، میکروسکوپی های طولانی مدت و انتقالات برون کاشتی را آسان می کند. همچنین استفاده از گالاکتوز می تواند تولید رادیکال آزاد کمتر و تنش اکسایشی پایین تری نسبت به گلوکز در سلول ایجاد کند. از آنجا که این محیط فرمولاسیون نسبتا پیچیده ای دارد (فهرست طولانی املاح و ویتامین ها)، در مواقعی که نیاز به تغذیه کامل سلول باشد مزیتی نسبت به محیط های ساده دارد. از طرف دیگر محدودیت هایی نیز دارد: اول اینکه چون محتوی سرم است باید با ۱۰٪ FBS یا مکمل های مشابه استفاده شود که هزینه و تغییرات متغیر سرمی را در بر دارد. دوم اینکه عدم وجود بافر بی کربنات یعنی در صورت تغییر شرایط دی اکسیدکربن محیط (مثلاً نگهداری طولانی در CO₂ بالا) ممکن است pH ناپایدار شود. سوم اینکه برخی سلول ها هنگام مهاجرت به این محیط ممکن است نیاز به شرایط انکوباسیون مجدد (تنظیم دما، O₂) داشته باشند. در نتیجه باید به مقایسه نتایج رشد با شرایط استاندارد توجه شود.
عیب یابی و مشکلات رایج
رایج ترین مشکل در کشت با L-15، استفاده نادرست از شرایط غیربافر آن است. به عنوان مثال، قرار دادن فلاسک L-15 در انکوباتور ۵٪ CO₂ بدون اصلاح مجدد pH می تواند منجر به اسیدی شدن سریع محیط شود. همچنین انبارش نامناسب محیط آماده شده (قرار دادن در نور زیاد یا بالای دمای توصیه شده) می تواند منجر به تغییر رنگ فینول رد یا کاهش کارایی شود. رسوب ناشی از تعویض های ناگهانی دما یا افزودن بیش از حد کربنات نیز ممکن است ایجاد گردد؛ در این موارد باید محیط را دوباره فیلتر کرده و ته نشین شدگی را حذف کرد. در صورت آلوده شدن محیط به کدورت یا بو، باید کل میکروب زدایی و پر کردن ابزار به درستی انجام گیرد، زیرا این محیط به دلیل تغذیه بالای سلولی حساس تر از بقیه محیط ها است. راهکارها شامل چک کردن pH پس از فیلتر، استفاده از ۱۰٪ FBS با کیفیت و افزودن آنتی بیوتیک/آنتی میکوتیک در صورت نیاز است. همچنین آزمون رشد سلولی (growth promotion test) برای تأیید توانایی محیط در حمایت از رشد سلول در دسته های جدید توصیه می شود.
کنترل کیفیت و استانداردها
هر دسته از پودر L-15 قبل از عرضه در آزمایشگاه کنترل کیفیت می شود. در کارخانه هایی با گواهی ISO-9001 تولید شده و از نظر میکروبی کاملاً استریل است. پس از آماده سازی، محیط باید از نظر pH، اسمولاریته و همچنین تست رشد سلول (growth promotion) بررسی گردد. بر اساس گزارش ATCC، اسمولاریته نهایی باید در محدوده ۳۰۵–۳۳۷ mOsm/kg و pH حدود ۷٫۳–۷٫۹ باشد. کنترل اندوتوکسین (کمتر از ۰٫۵ EU/ml) و عدم وجود آلودگی میکروبی برای اطمینان از نتایج تکرارپذیر ضروری است. پروسه های استاندارد کنترل کیفی شامل کشت سلول آزمون در این محیط و مقایسه با یک محیط مرجع است. شرکت های تولیدکننده معمولاً گزارش های کنترل کیفی (COA) را همراه محصول ارائه می دهند.
ایمنی و دفع زیست پسماند
محیط L-15 مانند سایر مواد آزمایشگاهی فقط برای استفاده پژوهشی در محیط کشت سلولی in vitro طراحی شده است. هنگام کار باید از دستکش، روپوش و عینک ایمنی استفاده کرد تا از تماس پوست با محلول یا ذرات پودر جلوگیری شود. در صورت تماس تصادفی با پوست یا چشم، محل را با آب فراوان بشویید. از آنجا که L-15 فاقد عوامل سمی ذکرشده است، ضایعات آن معمولاً پس از اتوکلاو در پسماند زیستی متداول قرار می گیرند. اما در صورت آلودگی (مثلاً اگر سلول یا ویروسی در محیط بوده) باید آن را در پوشک یا کیسه مخصوص زباله های برچسب خورده قرار داد و مطابق دستورالعمل های سازمان های بهداشتی محلی دفع نمود.
نسخه ها و تغییرات فرمولاسیون
نسخه استاندارد Leibovitz L-15 معمولاً حاوی ۲ میلی مولار L-گلوتامین، فینول رد و پیروات سدیم است. واریانت های دیگری نیز موجودند: برخی فاقد گلوتامین هستند و باید پیش از استفاده غلظت گلوتمین (مثلاً 2 mM) اضافه شود. نوع فاقد فینول رد برای کاربردهای میکروسکوپی فلورسانس ارائه می شود تا تداخلی با فلوروفورهای سلولی نداشته باشد. همچنین نوعی بافر HEPES افزوده وجود دارد که در شرایط CO₂ هم پایداری pH بهتری دارد. فرمول پودر ممکن است به شکل مرغوب با کیفیت GMP یا کیفیت تحلیلی ارائه شود، که هر دو عملکرد مشابهی دارندط نقش مهمی دارد. پایداری شرایط آن امکان طراحی آزمایش های دقیق تر را فراهم می کند.
اهمیت انتخاب صحیح محیط کشت در نتایج علمی
انتخاب این محیط باید بر اساس نوع سلول، هدف آزمایش و شرایط تجهیزات انجام شود. استفاده صحیح از آن می تواند کیفیت نتایج علمی را افزایش دهد و از خطاهای آزمایشگاهی جلوگیری کند.
