ایمونودیفیوژن دوطرفه چیست؟ (Ouchterlony Double Diffusion)
ایمونودیفیوژن دوطرفه (Ouchterlony Double Diffusion) یک تکنیک کلاسیک آزمایشگاهی در حوزه ایمنی شناسی و بیوشیمی است که برای تشخیص و مقایسه آنتی ژن ها و آنتی بادی ها استفاده می شود.
به زبان ساده:
در این روش، هم آنتی ژن و هم آنتی بادی به صورت همزمان در ژل دیفیوژن می کنند. جایی که آنتی ژن و آنتی بادی به غلظت تعادلی می رسند، حلقه رسوبی یا خط رسوبی (Precipitin Line) تشکیل می شود.
به عبارت دیگر، این روش واکنش اختصاصی بین آنتی ژن و آنتی بادی را به صورت مستقیم در ژل نمایش می دهد و امکان مقایسه و تشخیص چندین آنتی ژن همزمان را فراهم می کند.
این تکنیک اغلب برای شناسایی تداخل ها، شباهت ها و تفاوت های آنتی ژنی بین نمونه ها کاربرد دارد.
تعریف علمی
Ouchterlony Double Diffusion یک روش ایمونولوژیک است که در آن آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در ژل آگاروز یا ژل ژلاتینی قرار می گیرند و به سمت یکدیگر دیفیوژ می شوند.
وقتی که غلظت آنتی ژن و آنتی بادی به نقطه تعادل می رسد، رسوب قابل مشاهده ایجاد می شود.
این رسوب می تواند خط مستقیم، خط تلاقی یا خطوط مورب باشد که بیانگر شباهت یا تفاوت آنتی ژنی بین نمونه هاست.
به بیان دیگر، این تکنیک نمایش بصری واکنش اختصاصی آنتی ژن–آنتی بادی به صورت همزمان است.
تاریخچه Ouchterlony Double Diffusion
این تکنیک توسط Örjan Ouchterlony در دهه ۱۹۴۰ میلادی توسعه یافت.
هدف: ایجاد روشی ساده، قابل مشاهده و بدون نیاز به تجهیزات پیچیده برای بررسی واکنش آنتی ژن–آنتی بادی.
Ouchterlony روش خود را برای تشخیص بیماری ها و مطالعه واکنش های ایمونولوژیک معرفی کرد.
در دهه های بعد، این روش به استانداردی برای شناسایی و مقایسه آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در آزمایشگاه های تحقیقاتی و بالینی تبدیل شد.
محدوده فعالیت و حساسیت
حساسیت:
قابل مشاهده در محدوده میکروگرم پروتئین یا آنتی ژن
دامنه کاربرد:
شناسایی آنتی بادی ها در سرم یا مایعات بدن
مقایسه آنتی ژن های مختلف و تشخیص هم پوشانی آنتی ژنی
تشخیص واکنش های اختصاصی یا غیر اختصاصی
ویژگی عملیاتی:
ساده و قابل مشاهده با چشم
مناسب برای تحقیقات پایه و آزمایش های آموزشی
امکان پردازش چندین نمونه همزمان
اصل و منطق عملکرد
ژل آگاروز یا ژل ژلاتینی روی پلیت ریخته می شود.
حفره هایی (Wells) برای نمونه ها ایجاد می شوند:
حفره ای برای آنتی بادی
حفره هایی برای یک یا چند آنتی ژن
آنتی ژن و آنتی بادی همزمان دیفیوژ می شوند.
جایی که غلظت هر دو به تعادل برسد، خط رسوبی تشکیل می شود.
شکل و محل خطوط بیانگر ارتباط آنتی ژنی نمونه ها است:
خطوط متقاطع: تفاوت آنتی ژنی
خطوط همپوشان: تشابه یا یکسان بودن آنتی ژن ها
خطوط ناقص یا قوسی: واکنش جزئی یا اشتراکی
روش انجام (مرحله به مرحله)
1. آماده سازی ژل
استفاده از آگاروز با درصد مشخص
ریختن ژل در پلیت صاف و ایجاد سطح همگن
اجازه دهید ژل سفت شود و آماده شود
2. ایجاد حفره ها
حفره مرکزی برای آنتی بادی
حفره های پیرامونی برای آنتی ژن ها
فاصله ها و قطر حفره ها استاندارد باشد
3. افزودن نمونه ها
آنتی بادی در حفره مرکزی
آنتی ژن ها در حفره های پیرامونی
4. انکوباسیون
ژل در دمای اتاق یا شرایط مرطوب برای چند ساعت تا شب قرار می گیرد
دیفیوژن آنتی ژن و آنتی بادی اتفاق می افتد
5. شکل گیری خطوط رسوبی
خطوط رسوبی در محل تعادل غلظت آنتی ژن و آنتی بادی ظاهر می شوند
خطوط با چشم یا دستگاه تصویربرداری قابل مشاهده هستند
6. تحلیل نتایج
خطوط مستقیم: نشان دهنده واکنش کامل و اختصاصی
خطوط قوسی یا ناقص: نشان دهنده واکنش جزئی
خطوط متقاطع: بیانگر تفاوت آنتی ژنی بین نمونه ها
مقایسه خطوط با نمونه های کنترل برای تفسیر نتایج
کاربردهای Ouchterlony Double Diffusion
1. شناسایی آنتی بادی ها
بررسی واکنش سرم بیماران با آنتی ژن های مختلف
تشخیص بیماری های خودایمنی و عفونی
2. مقایسه آنتی ژن ها
تعیین شباهت یا تفاوت آنتی ژنی بین نمونه ها
مثال: بررسی همپوشانی پروتئین های ویروسی یا باکتریایی
3. تحقیقات ایمونولوژیک
مطالعه واکنش های اختصاصی و غیر اختصاصی
آموزش تکنیک های ایمونولوژی در آزمایشگاه ها
4. کاربردهای آموزشی
نمایش واکنش آنتی ژن–آنتی بادی بصری برای دانشجویان و محققان تازه کار
5. آزمایش های پایه
بررسی تداخل ها و شناسایی چندین آنتی ژن یا آنتی بادی در یک ژل
نتایج حاصل
خروجی به شکل خطوط رسوبی (Precipitin Lines) روی ژل
خطوط مستقیم: واکنش کامل و اختصاصی
خطوط ناقص یا قوسی: واکنش جزئی
خطوط متقاطع: تفاوت آنتی ژنی بین نمونه ها
داده ها کیفی و نیمه کمی بوده و قابلیت تفسیر بصری دارند
محدودیت ها و نکات مهم
نیمه کمی بودن نتایج (Semi-Quantitative)
زمان بر بودن (چند ساعت تا شب برای دیفیوژن)
حساس به درصد ژل و حجم نمونه
مناسب برای بررسی چندین آنتی ژن یا آنتی بادی، اما نمی تواند میزان دقیق غلظت را بدون مقایسه با استاندارد تعیین کند
مناسب برای تحقیقات پایه و تشخیص های اولیه
نیاز به کنترل های مثبت و منفی برای دقت
