تکنیک ایمونوهیستوشیمی

تکنیک ایمونوهیستوشیمی چیست؟

ایمونوهیستوشیمی (Immunohistochemistry – IHC) یکی از روش های بسیار مهم و گسترده در علوم پزشکی و تحقیقاتی است که به منظور شناسایی و بررسی پروتئین ها، آنتی ژن ها و مولکول های خاص در بافت ها استفاده می شود. این تکنیک ترکیبی از دو رشته ی علمی است: ایمونولوژی و هیستولوژی. به زبان ساده، IHC به ما امکان می دهد تا با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی، مولکول های هدف را در یک نمونه بافتی مشخص کرده و محل و میزان آن ها را مشاهده کنیم. این روش به دلیل دقت بالا و قابلیت مشاهده ی مستقیم در ساختار بافت، کاربرد فراوانی در تشخیص بیماری ها، تحقیقات سلولی و مطالعات علمی دارد.

تعریف ساده تکنیک ایمونوهیستوشیمی
ایمونوهیستوشیمی روشی آزمایشگاهی است که با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی، پروتئین ها یا آنتی ژن های خاص را در نمونه های بافتی شناسایی و با رنگ های قابل مشاهده یا فلورسنت آشکار می کند.

توضیح به زبان ساده تکنیک ایمونوهیستوشیمی
اگر بخواهیم IHC را خیلی ساده توضیح دهیم، می توان آن را مانند یک نقشه ی ویژه در بافت تصور کرد. فرض کنید در یک بافت چندین نوع سلول مختلف وجود دارد و شما می خواهید بدانید کدام سلول ها پروتئین خاصی را تولید می کنند. با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی که به این پروتئین می چسبند و با رنگ یا نشانگر قابل مشاهده شده اند، می توانید این سلول ها را مشخص کنید. وقتی نمونه زیر میکروسکوپ بررسی می شود، مناطقی که پروتئین هدف در آن ها وجود دارد به صورت رنگی یا فلورسنت دیده می شوند. این تکنیک به پزشکان و پژوهشگران کمک می کند تا تفاوت سلول ها، میزان بیان پروتئین و محل دقیق آن در بافت را به طور مستقیم مشاهده کنند.

تاریخچه ایمونوهیستوشیمی
ریشه های IHC به دهه ی 1940 میلادی برمی گردد. در سال 1941، آلبرت کونز و همکارانش اولین بار آنتی بادی ها را با فلوروکروم نشاندار کرده و واکنش های آنتی ژن–آنتی بادی را در بافت مشاهده کردند. این دستاورد نقطه ی شروع تکنیک های مدرن شناسایی مولکولی در بافت ها بود.

در دهه ی 1960 و 1970، دانشمندان موفق شدند آنتی بادی ها را با آنزیم هایی مانند پراکسیداز نشاندار کنند، که باعث شد پروتئین های هدف به صورت رنگی در نمونه های بافتی قابل مشاهده باشند. این نوآوری موجب شد IHC به ابزاری استاندارد در تشخیص پاتولوژیک و تحقیقات بالینی تبدیل شود. بعدها با پیشرفت فلوروکروم ها و تکنیک های خودکار، حساسیت، دقت و سرعت این روش افزایش یافت و گستره ی کاربرد آن به مطالعات سرطان، بیماری های عفونی، بیماری های خودایمنی و تحقیقات سلولی و مولکولی توسعه یافت.

مبنای علمی روش ایمونوهیستوشیمی
IHC بر اصول واکنش اختصاصی آنتی بادی–آنتی ژن و توانایی آنزیم ها یا فلوروکروم ها در آشکارسازی سیگنال بنا شده است.

اتصال آنتی بادی به آنتی ژن
آنتی بادی ها مولکول هایی هستند که به طور اختصاصی به آنتی ژن ها یا پروتئین های خاص متصل می شوند. این اتصال بسیار ویژه است و باعث می شود فقط سلول ها یا نواحی دارای آنتی ژن هدف رنگ آمیزی شوند.

نشاندار کردن آنتی بادی ها
آنتی بادی ها با آنزیم هایی مانند HRP (Horse Radish Peroxidase) یا AP (Alkaline Phosphatase) و یا فلوروکروم هایی مانند FITC نشاندار می شوند. این نشاندارها باعث آشکارسازی بصری محل اتصال آنتی بادی می شوند.

مشاهده و تحلیل
محل اتصال آنتی بادی به آنتی ژن با میکروسکوپ نوری یا فلورسنت بررسی می شود. شدت رنگ یا فلورسانس به میزان بیان پروتئین هدف مرتبط است و الگوی رنگی کمک می کند تا توزیع آن در بافت تحلیل شود.

روش انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی (شرح علمی مرحله به مرحله)

نمونه برداری و آماده سازی بافت
نمونه بافتی با بیوپسی یا جراحی گرفته می شود. نمونه معمولاً در فرمالین تثبیت و سپس در پارافین جاسازی می شود (FFPE – Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) یا در برخی موارد بافت تازه فریز می شود.

برش بافت
نمونه بافتی در میکروتوم برش داده می شود. برش ها معمولاً 4 تا 6 میکرومتر ضخامت دارند و روی لام شیشه ای قرار داده می شوند.

دِپارافینه کردن و بازسازی آنتی ژن
در نمونه های پارافینی، پارافین با محلول های ارگانیک حذف می شود. سپس فرآیند بازسازی آنتی ژن (Antigen Retrieval) با استفاده از حرارت یا بافرهای خاص انجام می شود تا اپی توپ های آنتی ژن قابل دسترس شوند.

مسدودسازی (Blocking)
برای جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی ها، بافت با محلول های مسدودکننده مانند سرم غیرایمن یا BSA پوشانده می شود.

افزودن آنتی بادی اولیه
آنتی بادی اختصاصی علیه پروتئین هدف روی نمونه اضافه می شود و معمولاً در دمای مناسب برای مدت مشخص انکوبه می شود تا اتصال کامل انجام شود.

شستشو
لام ها با بافر مناسب شسته می شوند تا آنتی بادی های غیرمتصل حذف شوند.

افزودن آنتی بادی ثانویه نشاندار
اگر آنتی بادی اولیه نشاندار نشده باشد، از آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم یا فلوروکروم استفاده می شود. این آنتی بادی به آنتی بادی اولیه متصل می شود و سیگنال قابل مشاهده تولید می کند.

افزودن سوبسترا
در مورد آنتی بادی های آنزیمی، سوبسترا اضافه می شود. این سوبسترا با آنزیم واکنش داده و رنگ قابل مشاهده تولید می کند. به عنوان مثال، DAB (Diaminobenzidine) با HRP واکنش می دهد و رنگ قهوه ای ایجاد می کند.

مشاهده با میکروسکوپ
نمونه با میکروسکوپ نوری یا فلورسنت بررسی می شود. محل، الگو و شدت رنگ نشان دهنده حضور و میزان پروتئین هدف در بافت است.

کاربردهای ایمونوهیستوشیمی

تشخیص سرطان ها
IHC نقش بسیار مهمی در تعیین نوع سلول های سرطانی، منشأ تومور و پروفایل مولکولی آن ها دارد. برای مثال:

تشخیص سرطان های اپیتلیالی با استفاده از آنتی سیتوکراتین

تعیین منشأ تومورهای متاستاتیک با مارکرهای اختصاصی (مثلاً TTF-1 برای ریه، CK7 و CK20 برای دستگاه گوارش)

تشخیص سرطان های هورمونی با مارکرهای ER، PR و HER2

بررسی بیماری های عصبی و مغزی
IHC برای شناسایی پروتئین های آمیلوئید، تاو و α-synuclein در بیماری های آلزایمر و پارکینسون استفاده می شود.

تشخیص عفونت ها
IHC می تواند حضور عوامل عفونی مانند ویروس ها، باکتری ها و قارچ ها را در بافت مشخص کند.

تحقیقات سلولی و مولکولی
مطالعات بیان پروتئین ها، مسیرهای سیگنالینگ و تعامل سلولی از طریق IHC انجام می شوند.

نتایج و تفسیر تکنیک ایمونوهیستوشیمی
نتایج IHC بر اساس چند پارامتر اصلی تفسیر می شوند:

مثبت یا منفی بودن
رنگ یا فلورسانس قابل مشاهده در محل سلول ها نشان دهنده وجود پروتئین هدف است.

شدت و درصد سلول های مثبت
تعداد سلول هایی که پروتئین هدف را بیان می کنند و شدت رنگ، نشان دهنده میزان بیان پروتئین است.

الگوی رنگ آمیزی
سلول های هسته ای، سیتوپلاسمی یا غشایی می توانند بسته به محل بیان پروتئین هدف رنگ آمیزی شوند.

مقایسه با کنترل ها
کنترل مثبت و منفی برای اطمینان از صحت آزمایش استفاده می شود.

محدوده فعالیت این روش
IHC در آزمایشگاه های پاتولوژی، ایمونولوژی، تحقیقاتی و مراکز تشخیص سرطان انجام می شود. تجهیزات مورد نیاز شامل:

میکروسکوپ نوری یا فلورسنت

میکروتوم و دستگاه برش بافت

انکوباتور و بافرهای تخصصی

آنتی بادی های اولیه و ثانویه نشاندار

سیستم های سوبسترا و کنترل کیفی

مزایا تکنیک ایمونوهیستوشیمی

اختصاصیت بالا

قابلیت مشاهده مستقیم محل پروتئین

کاربرد گسترده در تشخیص سرطان و بیماری ها

امکان استفاده در نمونه های پارافینی

محدودیت ها تکنیک ایمونوهیستوشیمی

وابسته به کیفیت آنتی بادی ها

نیاز به کنترل های دقیق

احتمال رنگ آمیزی غیر اختصاصی

زمان بر بودن برخی مراحل