طراحی پرایمر برای اسکورپیون ریل تایم پی سی آر

طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR چیست

طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR یک تکنیک پیشرفته در زیست شناسی مولکولی و تشخیص کمّی DNA یا RNA است. پروب های Scorpion ترکیبی از پرایمر و پروب فلورسانت در یک ساختار مو-شکل (Hairpin) هستند که هنگام اتصال به توالی هدف، سیگنال فلورسانت تولید می کنند. این ساختار باعث می شود واکنش PCR همزمان و درون مولکولی باشد و اختصاصیت و حساسیت بسیار بالایی ایجاد شود.

پرایمرهای Scorpion معمولاً برای تولید آمپلیکون کوتاه (۵۰–۱۵۰ جفت باز) طراحی می شوند تا بازده PCR بالا و همزمانی سیگنال فلورسانس تضمین شود. این روش نسبت به TaqMan و SYBR Green اختصاصیت بالاتری دارد و خطر تولید سیگنال پس زمینه کاهش می یابد.

به زبان ساده، طراحی پرایمر Scorpion مانند کلید و حسگر داخلی است؛ پرایمر بخش ابتدایی تکثیر را آغاز می کند و پروب Scorpion که به پرایمر متصل است تنها در حضور توالی هدف فلورسانس تولید می کند.

تعریف علمی طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR

از منظر علمی، طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR شامل مراحل زیر است:

انتخاب ناحیه هدف کوتاه و اختصاصی (۵۰–۱۵۰ جفت باز) برای تولید آمپلیکون با بازده بالا.

طراحی پرایمر ۱۸–۲۵ نوکلئوتیدی با درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ و Tm مناسب.

طراحی پروب Scorpion با طول ۲۰–۳۰ نوکلئوتید و Tm حدود ۵–۱۰°C بالاتر از پرایمر.

طراحی ساختار Hairpin پروب برای ایجاد حالت خاموش (quenching) در غیاب توالی هدف.

بررسی و حذف ساختارهای ثانویه پرایمر و پروب (Self-dimer، Cross-dimer).

اعتبارسنجی اختصاصیت پرایمر و پروب با پایگاه های داده ژنومی و نرم افزارهای BLAST و Primer-BLAST.

محاسبه Tm معمولاً با فرمول Nearest-Neighbor انجام می شود:

Tm = ΔH / (ΔS + R × ln[C/4]) – 273.15 + 16.6 × log[Na+]

که ΔH و ΔS انرژی های آنتالپی و آنتروپی اتصال، C غلظت پرایمر و [Na+] غلظت یون سدیم محیط PCR است. درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ تنظیم می شود تا اتصال اختصاصی و پایدار ایجاد شود.

تاریخچه طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR

پروب های Scorpion در اوایل دهه ۲۰۰۰ معرفی شدند و با هدف افزایش اختصاصیت و حساسیت نسبت به TaqMan qPCR طراحی گردیدند. ایده اصلی ترکیب پرایمر و پروب در یک ساختار Hairpin و اتصال درون مولکولی باعث شد واکنش سریع تر و با سیگنال قوی تر انجام شود.

این تکنیک به سرعت در تشخیص واریانت های نادر ویروسی و باکتریایی، اندازه گیری دقیق بیان ژن و تعیین کپی عدد ژن در تحقیقات بالینی و ژنتیک انسانی مورد استفاده قرار گرفت.

محدوده فعالیت طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR

پرایمرهای Scorpion qPCR در حوزه های زیر کاربرد دارند:

تشخیص اختصاصی ویروس ها و باکتری ها حتی در نمونه های با تعداد کم RNA/DNA.

اندازه گیری دقیق بیان ژن ها در سلول های محدود یا کلینیکی.

شناسایی جهش ها و واریانت های نادر با اختصاصیت بالا.

تعیین کپی عدد ژن و تحلیل SNPها در ژنتیک انسانی و حیوانی.

مطالعات اپیدمیولوژی و تحقیقاتی برای ردیابی ویروس ها و باکتری ها.

روش انجام طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR به صورت علمی
1. انتخاب ناحیه هدف

انتخاب آمپلیکون کوتاه (۵۰–۱۵۰ جفت باز) برای بازده بالای PCR و تولید سیگنال همزمان.

2. طراحی پرایمر و پروب

طول پرایمر: ۱۸–۲۵ نوکلئوتید

طول پروب Scorpion: ۲۰–۳۰ نوکلئوتید

Tm پروب حدود ۵–۱۰°C بالاتر از پرایمر

ساختار Hairpin پروب باعث خاموشی فلورسانس در غیاب هدف می شود

3. محاسبه Tm و درصد GC

Tm پرایمرها ±۲°C نزدیک هم

درصد GC بین ۴۰–۶۰٪ برای اتصال اختصاصی و پایدار

نرم افزارهای Primer3 و OligoAnalyzer برای محاسبه Tm و انرژی آزاد استفاده می شوند

4. بررسی اختصاصیت و ساختار ثانویه

جلوگیری از Hairpin، Self-dimer و Cross-dimer

بررسی اختصاصیت با BLAST و Primer-BLAST

5. اعتبارسنجی تجربی

اجرای qPCR و رسم نمودار Ct

بررسی Fluorescence Signal و اعتبارسنجی اختصاصیت محصول

مثال های کاربردی واقعی

تشخیص SARS-CoV-2 و Influenza: پرایمر و پروب Scorpion با آمپلیکون ۹۰–۱۲۰ جفت باز طراحی شدند و سیگنال اختصاصی حتی در نمونه های با RNA کمتر از ۱۰ مولکول ایجاد شد.

شناسایی جهش های نادر HIV: پروب های Scorpion امکان تشخیص واریانت هایی با فراوانی کمتر از ۱٪ را فراهم کردند.

اندازه گیری بیان ژن های محدود: پروب Scorpion برای ژن GAPDH در سلول های بنیادی استفاده شد و بیان دقیق mRNA اندازه گیری شد.

نتایج و مزایای استفاده از طراحی پرایمر برای Scorpion qPCR

افزایش اختصاصیت نسبت به TaqMan و SYBR Green

کاهش پس زمینه و سیگنال غیر اختصاصی

تشخیص جهش ها و واریانت های نادر حتی با فراوانی کم

بازده یکنواخت و قابلیت تکرارپذیری بالا

کاربرد گسترده در تشخیص ویروس، اندازه گیری بیان ژن و تعیین کپی عدد ژن

محدودیت ها و چالش ها

هزینه بالای تهیه پروب های Scorpion نسبت به SYBR Green

طراحی دقیق پرایمر و پروب نیازمند نرم افزار تخصصی و زمان بر است

اختلاف کوچک در Tm یا درصد GC می تواند بازده واکنش را تحت تأثیر قرار دهد

نمونه های با کیفیت پایین DNA/RNA ممکن است دقت نتایج را کاهش دهند