نئومایسین

 

Neomycin چیست؟

Neomycin یا نئومایسین یکی از آنتی بیوتیک های خانواده آمینوگلیکوزیدها است که به دلیل توانایی مهار سنتز پروتئین در باکتری ها، در حوزه های مختلف میکروبیولوژی، زیست شناسی سلولی و مولکولی مورد استفاده قرار می گیرد. این ترکیب در واقع شامل مجموعه ای از ترکیبات آمینوگلیکوزیدی مرتبط است و در کاربردهای آزمایشگاهی، نام آن معمولاً برای اشاره به فعالیت ضدباکتریایی این گروه به کار می رود.

در کشت سلول، آنتی بیوتیک ها ممکن است با دو هدف متفاوت مورد استفاده قرار گیرند؛ نخست، کاهش احتمال رشد باکتری های ناخواسته در محیط کشت و دوم، استفاده به عنوان عامل انتخابی در سیستم های مهندسی ژنتیک. این دو کاربرد از نظر هدف و نحوه طراحی آزمایش با یکدیگر تفاوت دارند و نباید آنها را یکسان در نظر گرفت.

در کاربردهای معمول کشت سلولی، وجود یک آنتی بیوتیک می تواند رشد برخی باکتری های حساس را مهار کند، اما این موضوع هرگز جایگزین تکنیک آسپتیک، استفاده از مواد استریل و پایش مستمر سلامت کشت نمی شود. در سیستم های انتخابی نیز ماده ضدباکتریایی به منظور انتخاب سلول هایی که یک ژن مقاومت مشخص را دریافت کرده اند، مورد استفاده قرار می گیرد.

جایگاه آمینوگلیکوزیدها در محیط کشت

آمینوگلیکوزیدها گروه مهمی از آنتی بیوتیک های ضدباکتریایی هستند که هدف اصلی آنها دستگاه سنتز پروتئین در سلول باکتریایی است. اعضای این خانواده از نظر ساختار شیمیایی، طیف فعالیت، قدرت اثر و الگوی مقاومت با یکدیگر تفاوت دارند، اما بسیاری از آنها با زیرواحد 30S ریبوزوم باکتریایی برهم کنش می کنند.

در آزمایشگاه کشت سلول، استفاده از این گروه باید کاملاً هدفمند باشد. سلول های یوکاریوتی دارای ریبوزوم هایی متفاوت از ریبوزوم باکتریایی هستند و همین تفاوت یکی از دلایل انتخاب این گروه به عنوان عوامل ضدباکتریایی در برخی سیستم های کشت است. با وجود این، غلظت بالا، تماس طولانی مدت یا شرایط نامناسب می تواند بر رفتار و عملکرد سلول های کشت شده اثر بگذارد.

بنابراین انتخاب یک آمینوگلیکوزید برای کشت سلول صرفاً بر اساس توانایی آن در مهار باکتری انجام نمی شود، بلکه تحمل سلول، هدف آزمایش، نوع کشت، نوع محیط و الزامات پروتکل نیز باید مورد توجه قرار گیرد.

مکانیسم اثر بر باکتری ها

مکانیسم اصلی اثر این ترکیب به اختلال در فرایند ترجمه پروتین در باکتری مربوط است. این ماده با اتصال به زیرواحد 30S ریبوزوم می تواند دقت خوانش mRNA را کاهش داده و باعث ورود اسیدهای آمینه نادرست به زنجیره پلی پپتیدی شود. در نتیجه، پروتئین های غیرطبیعی تولید شده و عملکرد طبیعی سلول باکتریایی دچار اختلال می شود.

این فرایند می تواند چندین مسیر حیاتی باکتری را تحت تأثیر قرار دهد و در شرایط مناسب به اثر باکتری کش منجر شود. شدت اثر به عواملی مانند گونه باکتری، غلظت ماده، شرایط فیزیولوژیک سلول و مکانیسم های مقاومت موجود در میکروارگانیسم بستگی دارد.

از نظر زیست شناسی سلولی، تفاوت ساختار ریبوزوم های پروکاریوتی و یوکاریوتی اهمیت زیادی دارد. با این حال، نباید نتیجه گرفت که آنتی بیوتیک در هر غلظتی برای سلول های پستانداران کاملاً بی اثر است. طراحی آزمایش باید بر اساس غلظت توصیه شده برای کاربرد مشخص و داده های مربوط به سلول مورد استفاده انجام شود.

طیف اثر و حساسیت میکروبی

این ماده در برابر طیفی از باکتری ها فعالیت دارد، اما حساسیت میکروارگانیسم ها به آن یکسان نیست. برخی باکتری های گرم منفی و تعدادی از باکتری های گرم مثبت می توانند نسبت به آن حساس باشند، در حالی که برخی گونه ها به دلیل مقاومت ذاتی یا اکتسابی، پاسخ مناسبی نشان نمی دهند.

مقاومت می تواند از طریق چندین مکانیسم ایجاد شود. تغییر در محل هدف، کاهش ورود آنتی بیوتیک به سلول، افزایش خروج ماده از سلول و تولید آنزیم های غیرفعال کننده از جمله سازوکارهایی هستند که می توانند حساسیت باکتری را کاهش دهند.

از این رو، وجود نئومایسین در محیط کشت به هیچ عنوان به معنای حذف همه باکتری های احتمالی نیست. اگر یک کشت سلولی دچار آلودگی شود، تشخیص عامل آلوده کننده و بررسی علت ایجاد آلودگی باید بر افزایش خودسرانه مقدار آنتی بیوتیک اولویت داشته باشد.

تفاوت با جنتامایسین، کانامایسین و استرپتومایسین

نئومایسین، جنتامایسین، کانامایسین و استرپتومایسین همگی در خانواده آمینوگلیکوزیدها قرار می گیرند، اما از نظر ساختار، فعالیت ضدباکتریایی و الگوی مقاومت کاملاً یکسان نیستند. بنابراین استفاده از آنها به عنوان جایگزین مستقیم یکدیگر، بدون توجه به پروتکل، می تواند باعث تغییر شرایط آزمایش شود.

در کشت سلول، برخی آزمایشگاه ها از Penicillin-Streptomycin به عنوان ترکیب رایج برای کاهش آلودگی باکتریایی استفاده می کنند، در حالی که در برخی پروتکل های دیگر ممکن است یک آمینوگلیکوزید منفرد انتخاب شود.

در مطالعات تحقیقاتی، مهم است که آنتی بیوتیک استفاده شده به صورت دقیق گزارش شود؛ زیرا حتی زمانی که دو ماده از یک خانواده دارویی باشند، تفاوت در طیف اثر و غلظت کاری می تواند بر نتیجه آزمایش تأثیر بگذارد.

کاربرد در کنترل آلودگی کشت سلولی

یکی از کاربردهای احتمالی نئومایسین در سیستم های کشت سلولی، کاهش رشد برخی آلودگی های باکتریایی حساس است. محیط کشت سلول به دلیل وجود آمینواسیدها، ویتامین ها، قندها و سایر ترکیبات غذایی، محیط مناسبی برای رشد بسیاری از میکروارگانیسم ها محسوب می شود.

در صورت ورود تعداد محدودی از باکتری های حساس، وجود یک آنتی بیوتیک مناسب می تواند رشد آنها را محدود کند و احتمال گسترش سریع آلودگی را کاهش دهد. با این حال، این اثر را نباید با استریل کردن محیط یا حذف قطعی آلودگی اشتباه گرفت.

استفاده از آنتی بیوتیک همچنین ممکن است نشانه های آلودگی را کاهش دهد. به همین دلیل، کشت هایی که در حضور آنتی بیوتیک نگهداری می شوند نیز باید به صورت منظم از نظر مورفولوژی سلول، وضعیت محیط، رشد غیرعادی و آلودگی های پنهان بررسی شوند.

کاربرد در سیستم های انتخاب سلولی

یکی از کاربردهای مهم این ترکیب در زیست شناسی مولکولی، استفاده از سیستم های انتخابی مبتنی بر مقاومت به نئومایسین است. در این سیستم ها معمولاً یک ژن مقاومت مناسب در یک سازه ژنتیکی قرار می گیرد و پس از ورود سازه به سلول، شرایط انتخابی ایجاد می شود تا سلول هایی که ژن مورد نظر را دریافت کرده اند نسبت به سلول های فاقد آن مزیت بقا داشته باشند.

این کاربرد با استفاده از آنتی بیوتیک برای پیشگیری از آلودگی در محیط کشت کاملاً متفاوت است. در selection، آنتی بیوتیک بخشی از طراحی آزمایش برای شناسایی یا غنی سازی جمعیت سلولی دارای marker مقاومتی است.

یکی از شناخته شده ترین سیستم ها استفاده از ژن مقاومت به نئومایسین یا ژن های مرتبط با مقاومت به aminoglycosides در سازه های بیان ژنی است. با این حال، شرایط انتخاب باید بر اساس نوع سلول و سیستم ژنتیکی به صورت تجربی یا طبق پروتکل معتبر تعیین شود.

غلظت مصرفی و اهمیت انتخاب مقدار مناسب

غلظت مورد استفاده یکی از حساس ترین پارامترها در کاربردهای سلولی است. مقدار بسیار پایین ممکن است توان کافی برای ایجاد فشار انتخابی یا مهار باکتری های هدف را نداشته باشد، در حالی که غلظت بیش از حد می تواند باعث ایجاد فشار غیرضروری بر سلول ها و کاهش viability آنها شود.

در سیستم های selection، غلظت مناسب به نوع سلول و هدف انتخاب وابسته است و معمولاً باید با استفاده از یک آزمایش تعیین حساسیت یا kill curve مشخص شود. این موضوع به ویژه در سلول های اولیه اهمیت دارد، زیرا پاسخ آنها ممکن است با خطوط سلولی immortalized متفاوت باشد.

برای تهیه غلظت کاری از یک محلول مادر، می توان از رابطه C1V1=C2V2 استفاده کرد. در این رابطه، C1 غلظت stock، V1 حجم مورد نیاز از stock، C2 غلظت نهایی و V2 حجم نهایی محیط است.

نباید یک غلظت انتخابی را بدون بررسی به تمام خطوط سلولی تعمیم داد؛ زیرا تفاوت های متابولیکی و فیزیولوژیک میان سلول ها می تواند باعث تفاوت چشمگیر در حساسیت آنها شود.

تعیین Kill Curve برای انتخاب سلولی

در کاربردهای انتخابی، تعیین Kill Curve یکی از مراحل مهم طراحی آزمایش است. هدف از این آزمایش مشخص کردن محدوده ای از غلظت است که بتواند سلول های فاقد مقاومت را طی یک بازه زمانی مناسب حذف کند، در حالی که سلول های دارای ژن مقاومت امکان بقا و تکثیر داشته باشند.

برای انجام این ارزیابی، سلول های فاقد سازه مقاومتی در معرض غلظت های مختلف قرار می گیرند و تغییرات viability و رشد آنها در طول زمان بررسی می شود. غلظتی که بتواند جمعیت حساس را به شکل قابل قبول حذف کند، می تواند به عنوان یکی از معیارهای تعیین شرایط selection در نظر گرفته شود.

این فرایند برای هر نوع سلول باید با توجه به شرایط آزمایش طراحی شود. استفاده از یک مقدار ثابت برای تمام خطوط سلولی می تواند باعث selection ناکافی یا ایجاد سمیت شدید شود.

محلول مادر و آماده سازی

این ماده می تواند به صورت پودر یا محلول تجاری عرضه شود. در آزمایشگاه کشت سلول، محلول استریل آماده مصرف می تواند فرایند کار را ساده تر کرده و احتمال خطا در تهیه و استریل سازی را کاهش دهد.

اگر فرم پودری مورد استفاده قرار گیرد، باید حلال، غلظت stock، شرایط حل شدن، استریلیزاسیون و نحوه نگهداری بر اساس دستورالعمل سازنده تعیین شوند. نباید برای هر ماده آنتی بیوتیکی یک روش آماده سازی عمومی در نظر گرفت.

محلول مادر تهیه شده باید دارای برچسب مشخص باشد. درج نام ماده، غلظت، تاریخ تهیه، تاریخ انقضا، شماره بچ و شرایط نگهداری باعث می شود ردیابی محلول در طول پروژه امکان پذیر باشد.

استفاده از aliquotهای مناسب نیز می تواند تعداد دفعات باز و بسته شدن ویال و تغییرات مکرر دمایی را کاهش دهد.

شرایط نگهداری و پایداری

پایداری آنتی بیوتیک ها به عوامل مختلفی از جمله دما، pH، غلظت، نور و نوع فرمولاسیون وابسته است. به همین دلیل، شرایط نگهداری باید دقیقاً از اطلاعات رسمی محصول استخراج شود.

محلول ها نباید در معرض شرایطی قرار گیرند که سازنده برای آن محصول ممنوع کرده است. همچنین چرخه های مکرر انجماد و ذوب در صورت توصیه نشدن می توانند کیفیت و پایداری محلول را تحت تأثیر قرار دهند.

در صورت مشاهده رسوب، تغییر رنگ، کدورت یا تغییر ظاهری غیرمعمول، استفاده از محلول باید متوقف شود تا علت مشخص شود. این موضوع به ویژه زمانی اهمیت دارد که محلول برای آزمایش های حساس یا انتخاب سلولی استفاده می شود.

نگهداری صحیح تنها برای حفظ فعالیت آنتی بیوتیک نیست، بلکه بخشی از سیستم کنترل کیفیت مواد مصرفی در آزمایشگاه محسوب می شود.

اثر احتمالی بر سلول های پستانداران

اگرچه هدف اصلی آمینوگلیکوزیدها ساختارهای باکتریایی است، سلول های پستانداران نیز ممکن است در شرایط خاص نسبت به ترکیبات موجود در محیط واکنش نشان دهند. میزان این اثر به نوع سلول، غلظت ماده، مدت تماس و شرایط فیزیولوژیک کشت وابسته است.

در سلول های حساس، غلظت نامناسب ممکن است با تغییر در رشد، کاهش viability یا تغییر مورفولوژی همراه شود. این موضوع در سلول های اولیه، سلول های بنیادی و مدل های تمایزی اهمیت بیشتری پیدا می کند.

اگر از ماده در یک آزمایش طولانی مدت استفاده می شود، بهتر است اثر آن بر وضعیت پایه سلول در شرایط مورد نظر مشخص باشد. چنین ارزیابی ای به ویژه زمانی مهم است که endpoint آزمایش شامل proliferation، differentiation، gene expression یا metabolic activity باشد.

تأثیر بر آزمایش های سلولی و مولکولی

در بسیاری از پژوهش های سلولی، محقق به دنبال بررسی یک تغییر ظریف در رفتار سلول است. در چنین شرایطی، هر متغیر اضافی در محیط کشت می تواند از نظر طراحی آزمایش اهمیت پیدا کند.

برای مثال، در آزمون های viability مانند MTT، resazurin یا ATP-based assays، وضعیت متابولیک سلول یکی از عوامل اصلی تعیین کننده نتیجه است. بنابراین شرایط کشت باید میان گروه های آزمایشی تا حد امکان یکسان باشد.

در مطالعات بیان ژن نیز تغییرات محیطی می توانند روی مسیرهای سلولی اثر بگذارند. اگر یک گروه سلولی با آنتی بیوتیک و گروه دیگر بدون آن نگهداری شود، ممکن است اختلاف مشاهده شده تنها ناشی از تیمار اصلی نباشد.

به همین دلیل، حضور یا عدم حضور آنتی بیوتیک باید از ابتدا در طراحی آزمایش مشخص شود.

ارتباط با مایکوپلاسما

مایکوپلاسما یکی از مهم ترین آلودگی های پنهان در کشت سلول است و حضور آن می تواند بدون ایجاد کدورت واضح در محیط، عملکرد سلول را تحت تأثیر قرار دهد. این میکروارگانیسم ها می توانند مواد غذایی محیط را مصرف کرده و بر متابولیسم، سرعت رشد و بیان ژن سلول میزبان اثر بگذارند.

وجود یک آنتی بیوتیک در محیط نباید به عنوان روشی قابل اعتماد برای جلوگیری از مایکوپلاسما در نظر گرفته شود. حتی اگر یک ترکیب بتواند رشد برخی باکتری ها را کاهش دهد، این موضوع به معنی کنترل کامل آلودگی مایکوپلاسما نیست.

پایش دوره ای با روش های اختصاصی مانند PCR یا آزمون های معتبر تشخیص مایکوپلاسما برای آزمایشگاه هایی که کشت سلولی انجام می دهند اهمیت زیادی دارد. این پایش به خصوص در پروژه هایی که از چند خط سلولی استفاده می شود، باید بخشی از برنامه کنترل کیفیت باشد.

محدودیت های استفاده مداوم

استفاده دائمی از آنتی بیوتیک می تواند باعث ایجاد یک مشکل مهم در کنترل کیفیت شود: آلودگی هایی که در شرایط عادی باید سریع شناسایی شوند، ممکن است برای مدتی پنهان بمانند.

وجود آنتی بیوتیک می تواند رشد باکتری های حساس را کاهش دهد، اما اگر عامل آلوده کننده نسبت به آن مقاوم باشد یا غلظت موجود برای مهار آن کافی نباشد، آلودگی می تواند ادامه پیدا کند.

از سوی دیگر، فشار انتخابی طولانی مدت ممکن است به بقای میکروارگانیسم های مقاوم تر کمک کند. بنابراین استفاده روتین از یک آنتی بیوتیک نباید به عنوان جایگزینی برای تکنیک آسپتیک و کنترل کیفیت در نظر گرفته شود.

در بسیاری از آزمایشگاه ها، بررسی دوره ای سلول ها در شرایط فاقد آنتی بیوتیک می تواند اطلاعات ارزشمندی درباره وضعیت واقعی کشت ارائه دهد.

تفاوت استفاده برای کنترل آلودگی و Selection

یکی از مهم ترین نکاتی که هنگام مطالعه درباره نئومایسین باید مورد توجه قرار گیرد، تفاوت میان antimicrobial supplementation و antibiotic selection است.

در حالت اول، مقدار مشخصی از آنتی بیوتیک برای کاهش احتمال رشد باکتری های حساس به محیط کشت اضافه می شود. هدف، حفظ سلامت کشت است و ماده نباید اثر نامطلوبی بر سلول مورد مطالعه ایجاد کند.

در حالت دوم، آنتی بیوتیک بخشی از سیستم انتخاب ژنتیکی است. سلول ها یا میکروارگانیسم هایی که ژن مقاومت مناسب را دارند، در شرایط انتخابی زنده می مانند و سایر جمعیت ها حذف می شوند.

به همین دلیل، غلظت و مدت زمان استفاده در این دو کاربرد الزاماً یکسان نیست. استفاده از یک مقدار عمومی برای هر دو هدف می تواند از نظر علمی نادرست باشد.

استفاده در سیستم های انتقال ژن

در برخی سیستم های ترانسفکشن، سازه DNA حاوی یک ژن marker برای مقاومت به آمینوگلیکوزیدها است. پس از ورود سازه به سلول، اعمال فشار انتخابی می تواند باعث غنی شدن جمعیت سلول هایی شود که سازه را دریافت کرده اند.

در این حالت، انتخاب آنتی بیوتیک بر اساس نوع marker موجود در vector انجام می شود. اگر سازه فاقد ژن مقاومت مرتبط باشد، استفاده از ماده انتخابی مورد نظر منطقی نخواهد بود.

همچنین موفقیت selection تنها به وجود آنتی بیوتیک وابسته نیست. کیفیت transfection، میزان بیان ژن مقاومت، وضعیت سلامت سلول و زمان شروع selection همگی می توانند بر نتیجه اثرگذار باشند.

در طراحی چنین آزمایش هایی، کنترل منفی فاقد سازه و کنترل مثبت دارای مقاومت می توانند برای ارزیابی عملکرد سیستم انتخابی بسیار مفید باشند.

سازگاری با محیط های کشت مختلف

آنتی بیوتیک معمولاً به یک محیط پایه مشخص محدود نیست و در پروتکل های مختلف ممکن است همراه با محیط هایی مانند DMEM، DMEM/F12، RPMI-1640، MEM، α-MEM یا سایر محیط های کشت سلولی استفاده شود.

با این حال، افزودن آن باید پس از آماده سازی صحیح محیط و تحت شرایط آسپتیک انجام شود. اگر محیط پایه دچار آلودگی یا تغییرات غیرطبیعی شده باشد، افزودن آنتی بیوتیک نمی تواند کیفیت آن را بازگرداند.

همچنین در محیط های مختلف، شرایطی مانند pH، اسمولاریته، مکمل ها و serum می توانند بر رفتار سلول و در نتیجه بر تحمل آن نسبت به شرایط انتخابی اثر داشته باشند.

بنابراین بهتر است شرایط کامل کشت در پروتکل ثبت شود و تنها نام محیط و آنتی بیوتیک گزارش نشود.

نقش کنترل کیفی و مستندسازی

کنترل کیفی این ماده از مرحله خرید آغاز می شود. هنگام دریافت محصول، اطلاعاتی مانند نام صحیح، گرید، غلظت، فرم محصول، شماره بچ، تاریخ انقضا و شرایط نگهداری باید بررسی و ثبت شوند.

پس از آماده سازی محلول نیز ثبت اطلاعات مربوط به stock solution اهمیت دارد. یک سیستم برچسب گذاری مناسب باید امکان شناسایی محلول، غلظت و زمان آماده سازی آن را فراهم کند.

در پروژه های تحقیقاتی، بهتر است شرایط کشت شامل نوع سلول، شماره پاساژ، محیط پایه، serum، مکمل ها و آنتی بیوتیک ها ثبت شود. این مستندسازی در صورت مشاهده تغییرات غیرمنتظره در رشد یا morphology سلول، به شناسایی علت کمک می کند.

در آزمایش هایی که برای انتشار علمی انجام می شوند، گزارش دقیق این اطلاعات باعث افزایش reproducibility و امکان تکرار مطالعه توسط سایر پژوهشگران خواهد شد.

نکات ایمنی هنگام کار

کار با مواد آنتی بیوتیکی باید بر اساس اصول ایمنی آزمایشگاه انجام شود. استفاده از تجهیزات حفاظت فردی مناسب و جلوگیری از تماس مستقیم با محلول ها از اقدامات پایه در هنگام آماده سازی و استفاده است.

اطلاعات ایمنی اختصاصی محصول باید از Safety Data Sheet یا SDS مربوط به همان ماده دریافت شود، زیرا شرایط نگهداری، خطرات تماس و الزامات دفع ممکن است بین فرمولاسیون ها و محصولات مختلف تفاوت داشته باشد.

محلول های تهیه شده نیز باید در ظروف دارای برچسب مناسب قرار گیرند و از نگهداری مواد در ظروف فاقد نام یا مشخصات جلوگیری شود.

پسماندهای حاوی مواد آنتی بیوتیکی و مواد آلوده به کشت سلولی نیز باید مطابق دستورالعمل مدیریت پسماند زیستی و شیمیایی آزمایشگاه دفع شوند.

مقاومت باکتریایی و اهمیت آن

مقاومت به آمینوگلیکوزیدها می تواند از طریق مکانیسم های مختلف ایجاد شود. برخی باکتری ها آنزیم هایی تولید می کنند که با تغییر شیمیایی ساختار آنتی بیوتیک، فعالیت آن را کاهش می دهند. مکانیسم های دیگری مانند تغییر محل اتصال یا کاهش ورود ماده به سلول نیز می توانند در مقاومت نقش داشته باشند.

این موضوع نشان می دهد که استفاده از آنتی بیوتیک نباید به شکل غیرضروری و بدون کنترل انجام شود. در کشت سلول، اگر آلودگی مشاهده شود، اولین اقدام نباید افزایش خودسرانه غلظت باشد.

بررسی منبع آلودگی، ارزیابی وضعیت کشت و تعیین اینکه آیا ادامه استفاده از آن کشت منطقی است یا خیر، از اقدامات مهم تر محسوب می شوند. در بسیاری از موارد، حذف یک کشت آلوده و جلوگیری از انتقال آن به سایر خطوط سلولی می تواند از گسترش مشکل در آزمایشگاه جلوگیری کند.

چه زمانی استفاده از آن مناسب نیست؟

استفاده از آنتی بیوتیک در همه شرایط کشت سلولی ضروری نیست. در برخی آزمایش ها، حضور آن می تواند یک متغیر اضافی ایجاد کند و تفسیر نتایج را دشوارتر سازد.

در مطالعاتی که اثر یک ماده ضدباکتریایی، برهم کنش سلول و میکروارگانیسم یا پاسخ های متابولیک خاص بررسی می شوند، تصمیم درباره وجود یا عدم وجود آنتی بیوتیک باید بر اساس هدف مطالعه انجام شود.

همچنین زمانی که سلول ها دچار آلودگی مشکوک شده اند، استفاده از مقدار بیشتر برای مخفی کردن نشانه های آلودگی روش مناسبی نیست. کشت مشکوک باید از نظر آلودگی بررسی شود و در صورت تأیید آلودگی، اقدامات مناسب برای جلوگیری از انتقال آن انجام گیرد.

در آزمایش های طولانی مدت نیز استفاده از آنتی بیوتیک باید با توجه به هدف مطالعه و اثر احتمالی آن بر فیزیولوژی سلول ارزیابی شود.

انتخاب محصول مناسب برای کشت سلول

برای خرید محصول مورد استفاده در کشت سلول، بهتر است محصولی انتخاب شود که کاربرد تحقیقاتی و مشخصات کیفی آن توسط تولیدکننده به طور شفاف اعلام شده باشد. عواملی مانند purity، concentration، formulation، sterility و storage conditions باید پیش از خرید بررسی شوند.

فرم آماده استریل برای برخی آزمایشگاه ها گزینه مناسبی است، زیرا نیاز به آماده سازی دستی را کاهش می دهد. در مقابل، فرم پودری می تواند برای آزمایشگاه هایی که نیاز به تهیه stock solution با غلظت های مختلف دارند انعطاف بیشتری فراهم کند.

قیمت نباید تنها معیار انتخاب باشد. حجم بسته بندی، غلظت stock، تعداد آزمایش های قابل انجام، شرایط نگهداری و کیفیت مستندات محصول نیز باید در ارزیابی نهایی در نظر گرفته شوند.

نکات مهم برای استفاده در پروتکل های تحقیقاتی

در یک پروتکل استاندارد، بهتر است مشخصات کامل آنتی بیوتیک ذکر شود و صرفاً نوشتن نام Neomycin کافی نباشد. غلظت محلول مادر، غلظت نهایی، نوع سلول، زمان شروع استفاده و هدف از افزودن ماده باید تا حد امکان مشخص باشند.

اگر هدف selection است، شرایط انتخاب باید برای همان cell line اعتبارسنجی شود. تعیین Kill Curve می تواند به مشخص شدن غلظتی کمک کند که جمعیت حساس را حذف کرده و در عین حال امکان بقا و رشد سلول های مقاوم را فراهم کند.

اگر هدف کنترل آلودگی است، استفاده از آنتی بیوتیک باید همراه با تکنیک آسپتیک مناسب باشد. ضدعفونی سطوح، استفاده صحیح از هود، استریل بودن محیط و ظروف، کنترل انکوباتور و پایش مایکوپلاسما همچنان اجزای اصلی مدیریت یک کشت سلولی سالم هستند.

در نهایت، ثبت دقیق شرایط استفاده باعث می شود نتایج آزمایش ها قابل تکرارتر باشند و در صورت مشاهده تغییر در رفتار سلول، امکان بررسی ارتباط آن با مواد مصرفی و شرایط کشت وجود داشته باشد.