استرپتومایسین در کشت سلول

استرپتومایسین در کشت سلول چیست؟

استرپتومایسین یکی از آنتی بیوتیک های شناخته شده خانواده آمینوگلیکوزیدهاست که به طور گسترده در کشت سلول های پستانداران و سایر سیستم های کشت سلولی مورد استفاده قرار می گیرد. هدف اصلی از اضافه کردن این ترکیب به محیط کشت، کاهش احتمال رشد و تکثیر باکتری های آلوده کننده است؛ زیرا مواد مغذی موجود در محیط های کشت می توانند شرایط بسیار مناسبی برای رشد میکروارگانیسم ها فراهم کنند.

این ماده در بسیاری از آزمایشگاه ها به صورت ترکیبی با پنی سیلین استفاده می شود. این ترکیب که با عنوان Penicillin-Streptomycin یا به اختصار Pen-Strep شناخته می شود، یکی از رایج ترین مکمل های آنتی بیوتیکی مورد استفاده در کشت سلولی است.

استرپتومایسین از نظر مکانیسم اثر با پنی سیلین تفاوت اساسی دارد. پنی سیلین ساخت دیواره سلولی باکتری را مختل می کند، در حالی که استرپتومایسین عمدتاً با هدف قرار دادن سیستم سنتز پروتئین باکتریایی عمل می کند. همین تفاوت مکانیسم باعث می شود ترکیب این دو ماده بتواند پوشش ضدباکتریایی گسترده تری ایجاد کند.

با وجود کاربرد گسترده، استفاده از این آنتی بیوتیک نباید به عنوان جایگزینی برای تکنیک آسپتیک در نظر گرفته شود. هدف اصلی استفاده از آن باید کاهش ریسک آلودگی باشد، نه پوشاندن خطاهای استریل یا ادامه دادن کار با یک کشت آلوده.

خانواده آمینوگلیکوزیدها و ویژگی های این ترکیب

استرپتومایسین در گروه آمینوگلیکوزیدها قرار دارد. آمینوگلیکوزیدها گروهی از آنتی بیوتیک ها هستند که اثر اصلی خود را از طریق اختلال در عملکرد ریبوزوم باکتری ایجاد می کنند.

یکی از ویژگی های مهم این خانواده، اثر آن ها بر سنتز پروتئین است. پروتئین ها برای رشد، تقسیم، ترمیم و عملکرد طبیعی سلول های باکتریایی ضروری هستند. هنگامی که فرآیند ترجمه پروتئین دچار اختلال شود، باکتری قادر به ادامه رشد طبیعی خود نخواهد بود.

ساختار مولکولی استرپتومایسین باعث می شود این ترکیب بتواند به زیرواحد کوچک ریبوزوم باکتری، یعنی 30S ribosomal subunit، متصل شود. این اتصال در نهایت باعث اختلال در خواندن صحیح RNA پیام رسان و تولید پروتین های غیرطبیعی می شود.

از نظر تاریخی، استرپتومایسین یکی از نخستین آنتی بیوتیک های مؤثر علیه برخی عفونت های جدی باکتریایی بود و کشف آن نقش مهمی در توسعه درمان های ضدباکتریایی مدرن داشت.

مکانیسم اثر در سطح ریبوزوم

مکانیسم اثر Streptomycin یکی از مهم ترین موضوعات برای درک کاربرد آن در کشت سلول است. این ترکیب با اتصال به بخش خاصی از زیرواحد 30S ریبوزوم باکتری، دقت فرآیند ترجمه را کاهش می دهد.

در حالت طبیعی، ریبوزوم باید کدون های موجود روی mRNA را به شکل صحیح شناسایی کند تا آمینواسید مناسب وارد زنجیره پروتئینی شود. استرپتومایسین این فرآیند را مختل کرده و احتمال خوانش اشتباه کدون ها را افزایش می دهد.

در نتیجه پروتئین هایی تولید می شوند که ممکن است ساختار یا عملکرد طبیعی نداشته باشند. تجمع این پروتئین های غیرطبیعی می تواند عملکرد سلول باکتری را مختل کرده و در نهایت به مرگ سلول منجر شود.

این مکانیسم با اثر پنی سیلین متفاوت است. به همین دلیل در محلول های Pen-Strep، دو آنتی بیوتیک از دو مسیر متفاوت برای کنترل آلودگی باکتریایی استفاده می شوند.

طیف اثر ضدباکتریایی

استرپتومایسین می تواند روی طیف مشخصی از باکتری ها اثر مهاری داشته باشد و به طور کلی فعالیت آن علیه بسیاری از باکتری های گرم منفی اهمیت ویژه ای دارد. با این حال حساسیت گونه های مختلف باکتریایی یکسان نیست و نمی توان آن را یک آنتی بیوتیک مؤثر علیه تمام آلاینده های احتمالی کشت سلول در نظر گرفت.

برخی باکتری ها به صورت ذاتی نسبت به آن مقاوم هستند و برخی دیگر نیز می توانند در اثر کسب مکانیسم های مقاومت، حساسیت خود را از دست بدهند.

نکته مهم این است که وجود Streptomycin در کشت سلولی نمی تواند از رشد تمام میکروارگانیسم ها جلوگیری کند. برای مثال، مایکوپلاسما به دلیل فقدان دیواره سلولی با این آنتی بیوتیک کنترل نمی شود.

بنابراین مشاهده رشد سلولی ظاهراً طبیعی در حضور Pen-Strep به هیچ عنوان به معنای عاری بودن کشت از آلودگی نیست.

غلظت استاندارد مورد استفاده در کشت سلول

در بسیاری از محصولات تجاری، Streptomycin همراه با Penicillin به صورت محلول 100X عرضه می شود. یکی از فرمولاسیون های بسیار رایج دارای غلظت استرپتومایسین 10 mg/mL است.

هنگامی که این محلول 100X به میزان یک درصد به محیط اضافه شود، غلظت نهایی استرپتومایسین به 100 µg/mL می رسد.

بنابراین اگر محلول استوک شما دارای غلظت 10 mg/mL باشد، برای هر 100 میلی لیتر محیط نهایی معمولاً یک میلی لیتر از محلول 100X استفاده می شود. در یک لیتر محیط نیز مقدار مورد نیاز 10 میلی لیتر خواهد بود.

با این حال، همیشه باید غلظت درج شده روی محصول سازنده ملاک محاسبه قرار گیرد، زیرا همه محصولات تجاری الزاماً فرمولاسیون کاملاً یکسانی ندارند.

چرا همراه پنی سیلین استفاده می شود؟

استفاده هم زمان از Penicillin و Streptomycin به دلیل تفاوت مکانیسم اثر این دو آنتی بیوتیک است.

پنی سیلین با مهار سنتز دیواره سلولی، عمدتاً باکتری های حساس به بتالاکتام ها را هدف قرار می دهد. استرپتومایسین در مقابل، با اتصال به ریبوزوم باکتریایی، سنتز پروتئین را مختل می کند.

ترکیب این دو ماده می تواند طیف بیشتری از باکتری های حساس را پوشش دهد و به همین دلیل محلول Penicillin-Streptomycin یکی از متداول ترین مکمل های آنتی بیوتیکی در آزمایشگاه های کشت سلول است.

با این حال، استفاده هم زمان از آن ها به معنای حذف نیاز به کنترل میکروبی نیست. در پروژه های حساس، آلودگی باید با روش های مناسب شناسایی و مستندسازی شود.

تأثیر بر سلول های پستانداران

سلول های پستانداران فاقد دیواره سلولی و ریبوزوم پروکاریوتی هستند؛ بنابراین هدف اصلی Streptomycin در سلول های جانوری وجود ندارد. به همین دلیل غلظت های استاندارد مورد استفاده در کشت سلولی معمولاً سمیت شدیدی ایجاد نمی کنند.

اما این موضوع به معنی آن نیست که استفاده از آنتی بیوتیک ها در هر شرایطی کاملاً بدون اثر است. نوع سلول، مدت تماس، غلظت ماده و حساسیت ذاتی سلول می توانند روی پاسخ نهایی تأثیر داشته باشند.

سلول های اولیه، سلول های بنیادی و برخی سلول های حساس ممکن است نسبت به تغییرات محیطی واکنش بیشتری نشان دهند. بنابراین در مطالعاتی که رشد، تمایز، متابولیسم یا بیان ژن اهمیت دارد، بهتر است شرایط آزمایش از نظر حضور آنتی بیوتیک به صورت کنترل شده طراحی شود.

اثر استفاده طولانی مدت بر رفتار سلولی

یکی از نکات مهم در کشت سلول این است که آنتی بیوتیک صرفاً یک ماده ضدباکتریایی نیست و ممکن است در برخی شرایط به عنوان یک عامل مداخله گر آزمایشی نیز مطرح شود.

استفاده طولانی مدت از Pen-Strep می تواند در بعضی مدل های سلولی با تغییر در مسیرهای متابولیکی، پاسخ های استرسی و الگوهای بیان ژن همراه باشد. میزان این اثر به شدت به سیستم آزمایشی وابسته است و نباید یک اثر ثابت و یکسان برای تمام خطوط سلولی در نظر گرفته شود.

به همین دلیل اگر هدف مطالعه بررسی تغییرات ظریف در عملکرد سلول باشد، بهتر است گروه کنترل و گروه آزمایشی از نظر وجود آنتی بیوتیک شرایط یکسانی داشته باشند.

در مطالعات بیان ژن، RNA sequencing، پروتئومیکس و بررسی پاسخ سلول به داروها، کنترل این متغیر می تواند اهمیت ویژه ای داشته باشد.

نقش استرپتومایسین در کنترل آلودگی باکتریایی

آلودگی باکتریایی یکی از رایج ترین مشکلات کشت سلولی است. ورود مقدار کمی از باکتری به یک محیط غنی می تواند در مدت کوتاهی باعث افزایش شدید جمعیت میکروبی شود.

استرپتومایسین با مهار سنتز پروتئین می تواند رشد بسیاری از باکتری های حساس را متوقف کند. این ویژگی باعث می شود احتمال از بین رفتن سریع کشت کاهش پیدا کند.

با این حال، اگر آلودگی مقاوم باشد، ممکن است آنتی بیوتیک قادر به کنترل آن نباشد. همچنین آنتی بیوتیک می تواند باعث شود آلودگی در مراحل ابتدایی به راحتی قابل مشاهده نباشد.

بنابراین اگر رشد سلول کاهش پیدا کند، مورفولوژی تغییر کند یا رفتار کشت غیرطبیعی شود، نباید صرفاً با افزایش مقدار آنتی بیوتیک تلاش کرد مشکل را برطرف کرد.

آیا استرپتومایسین روی مایکوپلاسما اثر دارد؟

یکی از مهم ترین محدودیت های Streptomycin در کشت سلولی، عدم توانایی آن در کنترل مایکوپلاسما است.

مایکوپلاسما فاقد دیواره سلولی است و بنابراین آنتی بیوتیک هایی که برای هدف قرار دادن ساختارهای خاص دیواره باکتری طراحی شده اند، روی آن اثر ندارند. علاوه بر این، برخی گونه های مایکوپلاسما می توانند بدون ایجاد کدورت واضح در محیط کشت تکثیر شوند.

آلودگی مایکوپلاسما ممکن است باعث کاهش سرعت رشد، تغییر متابولیسم، تغییر بیان ژن، تغییر پاسخ سلول به داروها و کاهش قابلیت تکرارپذیری آزمایش ها شود.

بنابراین استفاده از Pen-Strep به هیچ عنوان جایگزین Mycoplasma Testing نیست. آزمایش های دوره ای مایکوپلاسما باید بر اساس ریسک و سیاست آزمایشگاه انجام شوند.

استفاده در سلول های اولیه و سلول های بنیادی

در کشت سلول های اولیه و سلول های بنیادی باید نسبت به استفاده طولانی مدت از آنتی بیوتیک احتیاط بیشتری داشت. این سلول ها معمولاً نسبت به شرایط محیطی، تغییر pH، اسمولاریته، تراکم سلولی و ترکیبات موجود در محیط حساس تر هستند.

در برخی پروتکل ها ممکن است برای کاهش ریسک آلودگی در مراحل اولیه از آنتی بیوتیک استفاده شود، اما در مراحل حساس تمایز یا ارزیابی عملکرد سلولی، حذف آن می تواند منطقی تر باشد.

به خصوص زمانی که هدف بررسی تغییرات فنوتیپی، تمایز سلولی یا بیان ژن است، وجود یک عامل خارجی مانند آنتی بیوتیک باید به عنوان یکی از متغیرهای آزمایش در نظر گرفته شود.

کاربرد در آزمایش های MTT و سنجش زنده مانی

آزمون هایی مانند MTT، XTT، Resazurin و ATP-based assays برای ارزیابی وضعیت متابولیکی یا زنده مانی سلول ها مورد استفاده قرار می گیرند.

در این آزمایش ها هر عاملی که فعالیت متابولیکی سلول را تغییر دهد می تواند بر نتیجه اثر بگذارد. استرپتومایسین در غلظت استاندارد معمولاً اثر شدیدی ایجاد نمی کند، اما در مطالعات حساس بهتر است وجود یا عدم وجود آن در تمام گروه ها یکسان باشد.

برای مثال اگر گروه کنترل فاقد آنتی بیوتیک باشد ولی گروه تیمار حاوی Pen-Strep باشد، اختلاف مشاهده شده الزاماً تنها ناشی از ماده مورد مطالعه نخواهد بود.

به همین دلیل طراحی کنترل مناسب یکی از مهم ترین اصول در مطالعات Cytotoxicity و Drug Screening است.

کاربرد در مطالعات مولکولی

در آزمایش هایی مانند RT-PCR، qPCR، Western Blot، RNA-Seq و بررسی بیان پروتئین، وضعیت فیزیولوژیک سلول اهمیت بسیار زیادی دارد.

اگر شرایط کشت باعث ایجاد استرس یا تغییر متابولیسم سلول شود، ممکن است الگوی بیان ژن نیز تغییر کند. بنابراین هنگام طراحی آزمایش های مولکولی باید تمام عوامل محیطی، از جمله سرم، تراکم سلولی، مدت زمان کشت و حضور آنتی بیوتیک، تا حد امکان کنترل شوند.

در پروژه هایی که تفاوت بیان ژن بین دو گروه با دقت بالا بررسی می شود، استفاده از شرایط کشت یکسان اهمیت ویژه ای دارد.

چه زمانی بهتر است از محیط بدون آنتی بیوتیک استفاده شود؟

در بسیاری از آزمایشگاه ها توصیه می شود سلول ها برای دوره های طولانی به آنتی بیوتیک وابسته نباشند. دلیل اصلی این است که آلودگی در یک کشت بدون آنتی بیوتیک سریع تر قابل تشخیص خواهد بود.

اگر همیشه از آنتی بیوتیک استفاده شود، ممکن است یک آلودگی ضعیف برای مدت طولانی پنهان باقی بماند و در نهایت به یک مشکل جدی تبدیل شود.

همچنین در آزمایش های حساس، حذف آنتی بیوتیک می تواند تعداد متغیرهای مداخله گر را کاهش دهد.

البته تصمیم درباره استفاده یا عدم استفاده باید بر اساس نوع سلول، هدف آزمایش و SOP آزمایشگاه انجام شود و نمی توان یک قانون واحد برای تمام سیستم های کشت سلولی تعیین کرد.

استفاده هنگام ذوب سلول های فریز شده

در برخی آزمایشگاه ها هنگام احیای سلول های Cryopreserved از محیط حاوی Penicillin-Streptomycin استفاده می شود تا احتمال رشد آلودگی های باکتریایی کاهش پیدا کند.

پس از ذوب، سلول ها معمولاً در شرایط کنترل شده وارد مرحله Recovery می شوند و پس از تثبیت رشد، می توان بر اساس پروتکل آزمایشگاه درباره ادامه یا حذف آنتی بیوتیک تصمیم گرفت.

در این مرحله، پایش مورفولوژی سلول، سرعت رشد و سلامت کلی کشت اهمیت دارد. استفاده از آنتی بیوتیک نباید باعث شود آلودگی احتمالی بدون بررسی رها شود.

مقاومت باکتریایی نسبت به استرپتومایسین

مقاومت نسبت به آمینوگلیکوزیدها می تواند از مکانیسم های مختلفی ایجاد شود. برخی باکتری ها قادر به تغییر ساختار هدف دارو هستند، برخی با کاهش ورود آنتی بیوتیک به سلول مقاومت ایجاد می کنند و گروهی نیز آنزیم هایی تولید می کنند که دارو را تغییر داده و غیرفعال می کنند.

استفاده مداوم از غلظت های زیرحد استاندارد نیز می تواند فشار انتخابی ایجاد کند و بقای جمعیت های مقاوم را افزایش دهد.

به همین دلیل افزایش خودسرانه غلظت آنتی بیوتیک برای مقابله با یک کشت مشکوک، روش مناسبی برای کنترل آلودگی نیست. در صورت مشاهده علائم آلودگی، شناسایی عامل و بررسی منشأ آلودگی اهمیت بیشتری دارد.

شرایط نگهداری و پایداری

محلول استرپتومایسین باید مطابق دستورالعمل تولیدکننده نگهداری شود، زیرا پایداری آن به فرمولاسیون، غلظت، حلال و شرایط نگهداری بستگی دارد.

در بسیاری از محصولات تجاری، محلول استوک در دمای پایین، معمولاً فریزر، نگهداری می شود و برای جلوگیری از تخریب ناشی از چرخه های مکرر انجماد و ذوب، بهتر است محلول به Aliquotهای کوچک تقسیم شود.

محلول هایی که تغییر رنگ، کدورت، رسوب یا سایر تغییرات غیرطبیعی دارند نباید بدون بررسی مورد استفاده قرار گیرند.

همچنین باید از نگهداری طولانی مدت محلول در شرایطی غیر از شرایط توصیه شده توسط شرکت سازنده خودداری شود.

خطاهای رایج در مصرف Streptomycin

یکی از رایج ترین خطاها، محاسبه نادرست حجم محلول استوک است. برای این کار ابتدا باید غلظت استوک و سپس غلظت نهایی مورد نیاز مشخص شود.

خطای دیگر، اضافه کردن آنتی بیوتیک بدون توجه به حجم نهایی محیط است. اگر پس از افزودن مکمل ها حجم نهایی تغییر کند، محاسبه غلظت نیز باید بر اساس حجم نهایی انجام شود.

استفاده از محلول تاریخ گذشته، نگهداری نامناسب، Freeze-Thaw مکرر و اتکا به آنتی بیوتیک برای کنترل یک کشت آلوده نیز از اشتباهات مهم هستند.

همچنین نباید تصور کرد افزایش غلظت باعث ایجاد محافظت بیشتر و بهتر می شود؛ زیرا افزایش غلظت می تواند سمیت سلولی و اثرات ناخواسته را افزایش دهد.

جایگاه استرپتومایسین در کنترل کیفی کشت سلول

کنترل کیفیت کشت سلول تنها به بررسی ظاهر سلول ها محدود نمی شود. یک سیستم کنترل کیفیت مناسب می تواند شامل بررسی هویت سلول، مورفولوژی، نرخ رشد، Mycoplasma Testing و در پروژه های حساس بررسی آلودگی های باکتریایی و قارچی باشد.

در آزمایشگاه های تحقیقاتی، ثبت تاریخ Passage، شماره ویال، شرایط کشت، ترکیبات مورد استفاده و وضعیت آلودگی می تواند به افزایش قابلیت ردیابی کمک کند.

استفاده از Streptomycin تنها یکی از اجزای مدیریت ریسک آلودگی است و نباید به عنوان یک روش کنترل کیفیت مستقل در نظر گرفته شود.

نکات مهم در کاربرد صنعتی و آزمایشگاه های GMP

در فرآیندهای تحقیقاتی و صنعتی مرتبط با محصولات سلولی و بیولوژیک، استفاده از آنتی بیوتیک باید کاملاً بر اساس فرآیند تعریف شده و مستند انجام شود.

در سیستم های تولیدی، کنترل آلودگی باید بیشتر بر پایه طراحی مناسب فرآیند، تجهیزات مناسب، تکنیک آسپتیک، کنترل محیط، آموزش پرسنل و پایش میکروبی باشد.

در بسیاری از فرآیندهای تولید محصولات سلولی، استفاده از آنتی بیوتیک در مراحل خاص محدود یا حذف می شود، زیرا باقی مانده آنتی بیوتیک می تواند از نظر کنترل کیفیت، ایمنی محصول و الزامات فرآیندی اهمیت داشته باشد.

به همین دلیل تفاوت زیادی میان استفاده تحقیقاتی از Pen-Strep در یک فلاسک آزمایشگاهی و استفاده از آنتی بیوتیک در یک فرآیند تولید صنعتی وجود دارد.

تفاوت Streptomycin با Penicillin در کشت سلول

اگرچه این دو ماده معمولاً در یک محلول تجاری کنار یکدیگر قرار می گیرند، اما عملکرد آن ها کاملاً متفاوت است.

Penicillin یک آنتی بیوتیک بتالاکتام است که سنتز دیواره سلولی باکتری را مختل می کند، در حالی که Streptomycin یک آمینوگلیکوزید است که با هدف قرار دادن ریبوزوم باکتریایی، سنتز پروتئین را مختل می کند.

به همین دلیل ترکیب آن ها می تواند نسبت به استفاده از هر یک به تنهایی، طیف وسیع تری از باکتری های حساس را کنترل کند. با این حال هیچ یک از این دو ماده برای کنترل مایکوپلاسما کافی نیستند و حضور آن ها نیز تضمینی برای استریل بودن کشت محسوب نمی شود.